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Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1418 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mehrzellige filamentöse Pilze verfügen über septale Poren, die den zytoplasmatischen Austausch und damit die Konnektivität zwischen benachbarten Zellen im Filament ermöglichen. Hyphenverletzungen und andere Stresszustände induzieren den Verschluss der Septumporen, um den Zytoplasmaverlust zu minimieren. Die Zusammensetzung der Septumpore und die ihrer Funktion zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch nicht vollständig verstanden. Hier haben wir uns zum Ziel gesetzt, neue Septumkomponenten zu identifizieren, indem wir die subzelluläre Lokalisierung von 776 nicht charakterisierten Proteinen in einem mehrzelligen Ascomyceten, Aspergillus oryzae, bestimmen. Der Satz von 776 nicht charakterisierten Proteinen wurde auf der Grundlage ausgewählt, dass ihre Gene in den Genomen von mehrzelligen Ascomyceten mit septalen Poren (drei Aspergillus-Arten, in der Unterteilung Pezizomycotina) vorhanden waren und in den Genomen von Ascomyceten mit septalen Poren nicht vorhanden/divergent waren ( Hefen). Bei der Bestimmung ihrer subzellulären Lokalisierung wurde festgestellt, dass sich 62 Proteine ​​im Septum oder in der Septumpore lokalisieren. Die Löschung der kodierenden Gene ergab, dass 23 Proteine ​​an der Regulierung der Verstopfung der Septumporen bei Hyphenverletzungen beteiligt sind. Somit bestimmt diese Studie die subzelluläre Lokalisierung vieler nicht charakterisierter Proteine ​​in A. oryzae und identifiziert insbesondere eine Reihe von Proteinen, die an der Funktion der Septumporen beteiligt sind.

Die Entstehung der Mehrzelligkeit stellt einen wichtigen Übergang in der Evolutionsgeschichte dar. Organismen unterschiedlicher Herkunft haben sich in einfachen mehrzelligen Morphologien wie Filamenten, Clustern und Schichten organisiert, in denen die interzelluläre Kommunikation aufgrund des Fehlens direkter Durchgänge in der nachfolgenden Zellpopulation begrenzt ist1,2. In der relativ späten Evolutionsgeschichte haben mehrere Gruppen eukaryotischer Organismen durch Zell-Zell-Adhäsion und Entwicklungsprogramme eine komplexe Vielzelligkeit entwickelt, um sich in Gewebe, Fortpflanzungsorgane und Fruchtkörper zu differenzieren1,3. Darüber hinaus haben komplexe mehrzellige Organismen über ultrastrukturelle Durchgänge Zell-zu-Zell-Konnektivität entwickelt, um die Signalübertragung zu erleichtern4,5,6. Eine solche Zell-zu-Zell-Konnektivität hat sich unabhängig voneinander bei Tieren, Pflanzen und mehrzelligen Pilzen entwickelt; Darüber hinaus verschafft seine Regulierung selektive Vorteile in ungünstigen Umfeldern. Bei Tieren werden Gap Junctions, die den Durchgang von Ionen und kleinen Molekülen ermöglichen, durch oxidativen Stress strukturell und funktionell gestört7. In Pflanzen können Plasmodesmen, die den Transport von Transkriptionsfaktoren und Signalmolekülen von Zelle zu Zelle vermitteln, durch Kalloseablagerung als Reaktion auf Stress blockiert werden8.

Zu den Pilzen gehören sowohl septale Poren tragende (Filamentpilze) als auch solche, denen es an Septumporen (Hefen) fehlt, was die Charakterisierung der septalen porenbezogenen Organisation auf der Grundlage von Vergleichen erleichtert. Pilzhyphen wachsen durch Ausfahren polarisierter Spitzen und unterteilen sich mit Septen je nach Zellgröße und Kernteilung weiter9. In der Mitte des Septums befindet sich eine Septumpore, die den Austausch zytoplasmatischer Bestandteile zwischen flankierenden Zellen ermöglicht10,11. Im Unterstamm Pezizomycotina von Ascomycota können diese Poren durch den aus Peroxisomen stammenden, pilzspezifischen Woronin-Körper verstopft werden12. Im Gegensatz dazu haben Arten des Subphylums Agaricomycotina von Basidiomycota eine vom endoplasmatischen Retikulum abgeleitete septale Porenkappe (SPC) entwickelt, um die Poren zu blockieren13,14. Eine Mutante, der das Woronin-Körpermatrixprotein Hex1 fehlt, zeigte bei der Hyphenverletzung einen erheblichen Verlust von Zytoplasma aus flankierenden Zellen über Septumporen12.

Die Funktion der Septumporen wird dynamisch als Reaktion auf mechanische, umweltbedingte und physiologische Bedingungen reguliert. Belastungen wie niedrige Temperaturen und niedriger pH-Wert verringern die Zell-Zell-Konnektivität über unbekannte Mechanismen10,11. Hyphenverletzungen und abiotischer Stress induzieren die Anhäufung von septalporenassoziierten (SPA) Proteinen und des SO (oder SOFT)-Proteins an der Pore15,16,17. Darüber hinaus schließt sich die Pore vorübergehend während der Mitose und öffnet sich während der Interphase, wenn Nima-Kinase, ein Zellzyklusregulator, vom Zellkern zur Septumpore wandert18. Septumporen werden auch durch physiologische Bedingungen wie das Alter der Hyphen moduliert11,19, was auf die Beteiligung zusätzlicher Komponenten an der Regulierung ihrer Funktionen schließen lässt. Angesichts dieser dynamischen Verhaltensweisen der Septumporenregulation mangelt es an unserem Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen, insbesondere angesichts der begrenzten Kenntnisse der Woronin-Körperfunktion.

Es wird angenommen, dass sich Hyphen, das Kennzeichen der Vielzelligkeit von Pilzen, schon früh in der Pilzevolution entwickelt haben, möglicherweise in früh divergierenden Pilzen wie Blastocladiomycota, Chytridiomycota, Zoopagomycota und Mucoromycota20. Mithilfe eines groß angelegten Genomvergleichs konnten Kiss et al. schlugen eine Reihe von Genen vor, die an der Hyphenmorphogenese beteiligt sind und die von allen Pilzklassen gemeinsam genutzt werden, unabhängig davon, ob filamentöse Hyphen vorhanden sind oder nicht20. Darüber hinaus weisen Pilzarten innerhalb von Pezizomycotina und Agaricomycotina in der Regel einen erheblichen Zuwachs an Genfamilien auf, wie beispielsweise durch morphologische Komplexitäten wie Septumporen veranschaulicht wird, während Hefen eine höhere Rate an Genverlusten aufweisen20,21. Die Morphologie der Hyphen wird im Allgemeinen als Grundlage der Vielzelligkeit von Pilzen angesehen, während sich die Entstehung und Regulierung der Septumporen in mehrzelligen Abstammungslinien unabhängig voneinander entwickelt haben, was weitere morphologische Komplexitäten mit sich bringt. Diese Evolutionsschritte bei der Entstehung und Regulierung von Septumporen sind jedoch nach wie vor kaum verstanden.

Hier kombinierten wir genomische Vergleiche zwischen Septumporen tragenden und fehlenden Ascomyceten mit einem groß angelegten Lokalisierungsscreening von möglichen Septumporenproteinen, um neue Septumkomponenten zu identifizieren. Wir fanden heraus, dass die Septumpore ein Fokus für die Lokalisierung der Proteine ​​ist, die an ihrer dynamischen Regulierung beteiligt sind. Mithilfe eines bioinformatischen Ansatzes, einschließlich umfangreicher phylogenetischer Analysen, haben wir die Muster der Genentwicklung aufgeklärt, die bei der Verstopfung der Septumporen bei Hyphenverletzungen eine Rolle spielen.

Hier wurde Aspergillus oryzae verwendet, da fortschrittliche experimentelle Techniken zur Quantifizierung der Septumporenverstopfung bei durch hypotonen Schock verursachten Hyphenverletzungen sowie zur Quantifizierung der Zell-zu-Zell-Konnektivität bei Kältestress unter Verwendung photokonvertierbarer fluoreszierender Proteine ​​verfügbar sind10,16,19, 22,23. Das Genom von A. oryzae wurde mit denen der septalporentragenden Schlauchpilze A. nidulans, A. fumigatus und Neurospora crassa (Pezizomycotina) sowie der septalporenfreien Schlauchpilze Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans (Saccharomycotina) und Schizosaccharomyces pombe verglichen ( Taphrinomycotina) mit BLASTp (Abb. 1a). Zunächst wurden die Proteine ​​verglichen, von denen bekannt ist, dass sie bei der zellulären Morphogenese eine Rolle spielen (kodiert durch 243 Gene, die Orthologe in A. fumigatus20 haben) (Ergänzungsdaten 1a). Die Mehrzahl der Proteine ​​aus den septalporentragenden Spezies zeigte höhere Sequenzhomologien (Abb. 1a, blaue Blase im oberen Blasendiagramm), und eine beträchtliche Anzahl von Proteinen wies auch Sequenzhomologien mit Proteinen aus den septalporenfreien Spezies auf (Abb. 1a, rote und blaue Blasen im oberen Blasendiagramm). Dies deutet darauf hin, dass sich mit der Zellmorphogenese zusammenhängende Gene vor ihrer Divergenz entwickelten. In ähnlicher Weise analysierten wir Proteine, von denen bekannt ist, dass sie bei der Regulierung der Septumporen eine Rolle spielen (Ergänzungsdaten 1b basierend auf früheren Berichten 15, 16, 17, 23, 24). Die meisten dieser Proteine ​​zeigten keine oder nur begrenzte Homologien mit Proteinen der Spezies ohne Septumporen (Abb. 1a, grüne Blase im unteren Blasendiagramm), während viele Sequenzhomologien mit den Spezies mit Septalporen aufwiesen (Abb. 1a, blaue Blase). im unteren Blasendiagramm). Dieses Ergebnis legt nahe, dass diese Proteine ​​in der Abstammungslinie entstanden, die zu Pezizomycotina führte, in Ascomyceten-Hefen jedoch verloren gingen oder divergierten. Um die Konservierung proteinkodierender Gene umfassender zu analysieren, verglichen wir anschließend ganze Proteomdatensätze der oben genannten Arten mit dem Proteom von A. oryzae. Eine große Anzahl von Proteinen mit höheren Sequenzhomologien wurde in den septalen Poren tragenden Spezies gefunden, eine geringere Anzahl wurde jedoch in den septalen Poren fehlenden Spezies gefunden (Abb. 1a, blauer Balken im Balkendiagramm). Diese Erhaltungstendenz ähnelt der, die in einer vergleichenden Analyse unter Verwendung der an der Septumporenregulation beteiligten Proteine ​​​​erhalten wurde (Abb. 1a, unteres Blasendiagramm). Basierend auf diesen Erkenntnissen stellten wir die Hypothese auf, dass Proteine, die an der Regulierung der Septumporen beteiligt sind, bei Arten mit Septumporen konserviert sein könnten, bei Arten ohne Septumporen jedoch fehlen oder divergieren.

ein BLASTp-basierter genomischer Vergleich zwischen septalporentragenden und -mangelnden Ascomyceten. Die oberen Diagramme der Hyphen zeigen die Morphologie der Hyphen, und die unteren Diagramme der Hyphen mit perforierten Septen zeigen die Septumpore und ihre Regulierung. Die Blasengröße ist proportional zur Anzahl bekannter Proteine, die an der zellulären Morphogenese (oberes Blasendiagramm, ergänzende Daten 1a) und der Septumporenregulation (unteres Blasendiagramm, ergänzende Daten 1b) beteiligt sind. Im Balkendiagramm stellt die Y-Achse die Anzahl der gesamten proteinkodierenden Gene pro analysiertem Genom dar. Die Farben in Blasen und Balken stellen die Proteine ​​innerhalb der analysierten BLASTp e-Werte dar; Blau, Rot und Grün zeigen BLASTp e-Wertbereiche ≤1,0e-100, ≤1,0e-30 (>1,0e-100) bzw. >1,0e-30 an. b Strategie zur Auswahl geeigneter Septumporenproteine.

Um Kandidaten für Septumporenproteine ​​auszuwählen, haben wir nach Genen gescreent, die in den septalporentragenden Ascomyceten A. oryzae, A. fumigatus und A. nidulans konserviert sind (e-Werte ≤ 1,0e-100 in BLASTp), aber im Septum fehlen oder divergieren Porenlose Ascomyceten S. cerevisiae, C. albicans und S. pombe (e-Werte ≥1,0e-30 in BLASTp) (Abb. 1b). Insgesamt wurden 2130 Gene als potenzielle Kandidaten identifiziert. Diese Gene wurden weiterhin zur Auswahl nicht charakterisierter Kandidaten verwendet, für die keine biologischen Daten zu Begriffen der Genontologie (GO) verfügbar sind. molekulare Funktion, zelluläre Komponente und biologischer Prozess (Abb. 1b). Infolgedessen wurde schließlich eine Untergruppe von 776 nicht charakterisierten Kandidatengenen für Septumporenproteine ​​(Supplementary Data 2) ausgewählt.

Kandidatengensequenzen wurden aus der Aspergillus-Genomdatenbank AspGD abgerufen (derzeit geschlossen, der Datensatz ist jedoch in der FungiDB-Datenbank verfügbar; https://fungidb.org/fungidb/app). Wie in früheren globalen Analysen der Proteinlokalisierung in angehenden25 und spaltenden Hefen26 berichtet, wurde jedes der 776 Kandidatengene an seinem 3'-Ende unter der Kontrolle des induzierbaren amyB-Promotors27 mit egfp fusioniert (Abb. 2a). Die Expressionskassetten wurden durch homologe Rekombination ektopisch in den niaD-Locus des A. oryzae-Stammes NSlD110 eingefügt (Abb. 2a und ergänzende Daten 3: Stammliste).

a Schematische Darstellung der Expressionskassette für EGFP-Fusionen ausgewählter Proteine, die in das A. oryzae-Genom eingefügt werden sollen. b Subzelluläre Lokalisierungen der 776 Proteine. Es werden repräsentative konfokale Fluoreszenzmikroskopaufnahmen der Lokalisierungskategorien gezeigt; Pfeile zeigen Septen an. Maßstabsbalken, 5 μm.

Von den 776 resultierenden Stämmen konnten wir EGFP-Fluoreszenz in den lebenden Hyphen von 687 (88,5 %) Stämmen nachweisen (Abb. 2b). Ihre Lokalisierungsmuster wurden dann in fünf Kategorien eingeteilt: organellenartig, zytoplasmatisch, peripher, Hyphenspitze und Septum/Septalpore (Abb. 2b). Insgesamt wurden 314 (40, 5 %) Proteine, die sich überwiegend als kugelförmige Strukturen, Netzwerke und Puncta lokalisieren, die Zellorganellen ähneln, als „organellenartige“ Lokalisierung kategorisiert (Abb. 2b und ergänzende Abb. 1). Bei 288 (37,1 %) Proteinen wurde eine diffuse, gleichmäßige zytoplasmatische Färbung beobachtet, während 30 (3,9 %) eine periphere Lokalisierung aufwiesen (Abb. 2b und ergänzende Abb. 2 und 3a). Viele der peripheren Proteine ​​überlappten jedoch mit organellenähnlichen Verteilungen (ergänzende Abbildung 3a), wahrscheinlich aufgrund ihrer Präsenz im Sekretionsweg. Neunzehn der peripher lokalisierten Proteine ​​enthielten Signalpeptide und/oder Transmembrandomänen (ergänzende Abbildung 3a), was diese Hypothese stützt. Achtzehn (2,3 %) Proteine ​​waren an der Hyphenspitze lokalisiert (Abb. 2b und ergänzende Abb. 3b), wohingegen die verbleibenden 89 Proteine ​​(in den ergänzenden Daten 4 aufgeführt) keine nachweisbaren EGFP-Signale lieferten.

Wichtig ist, dass 62 Proteine ​​(8,0 %) im Septum oder in der Septumpore lokalisiert sind (Abb. 2b). Neunundvierzig davon waren unter normalen Wachstumsbedingungen septal (Abb. 3a, b und ergänzende Abb. 4a – c), und die restlichen 13 sammelten sich bei Hyphenverletzung in der Septumpore an (Abb. 3c und ergänzende Abb. 4d). Interessanterweise wiesen fünf Septumproteine ​​​​überlappende Verteilungen mit denen der Hyphenspitzenkategorie auf (ergänzende Abbildung 3b), was auf gemeinsame regulatorische Netzwerke zwischen Septum und Hyphenspitze schließen lässt.

Die apikalen Septen von Stämmen, die EGFP-fusionierte Proteine ​​exprimieren, wurden mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie unter normalen Kontrollwachstumsbedingungen und nach Hyphenverletzung analysiert. Cartoons stellen die am Septum beobachteten Lokalisierungsmusterkategorien dar. a Lokalisation um die Septumpore. b Lokalisation auf beiden Seiten des Septums. c Akkumulation von nicht-septalen SPP-Proteinen in der Septumpore nach Hyphenverletzung durch hypotonen Schock. Weiße Pfeile zeigen die Septen an, und rote Pfeilspitzen zeigen die Ansammlung von Septumporen an. Maßstabsbalken, 5 μm.

Insgesamt ermöglichte uns unsere auf Bioinformatik basierende Screening-Strategie, viele Proteine ​​zu finden, die eine Lokalisierung im Zusammenhang mit dem Septum aufweisen.

Von den 62 Septumproteinen fanden wir später heraus, dass 23 funktionell an der Verstopfung der Septumporen bei einer Hyphenverletzung beteiligt waren (siehe Abb. 4b) und bezeichneten sie als Septumporenverstopfungsproteine ​​(SPP) mit einer alphabetischen Reihenfolge der funktionellen Bedeutung in den Septumporen. Verstopfungsaktivität (Abb. 4b).

a Schematische Darstellung des Platzens der Hyphenspitze durch hypotonen Schock. Cartoons und DIC-Bilder zeigen verletzte Hyphen, die benachbarte Zellen vor Zytoplasmaverlust schützen können (oben) oder nicht (unten). Maßstabsbalken, 5 μm. b Schutz flankierender Zellen vor übermäßigem Zytoplasmaverlust bei Hyphenverletzung. In jedem Experiment wurden dreißig zufällig ausgewählte Hyphen beobachtet, die ein Aufplatzen der Hyphenspitze zeigten. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt und auf der Y-Achse ist der Prozentsatz der Hyphen dargestellt, die vor dem übermäßigen Zytoplasmaverlust geschützt waren. Die Daten werden als Mittelwert wiederholter Experimente dargestellt und Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des zweiseitigen Student-t-Tests getestet: *P < 0,05, **P < 0,01. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. c SppA-Lokalisierung an der Stelle der Septumbildung. Die Stämme wurden 8 Stunden lang in flüssigem CD-Medium (2 % Glucose), ergänzt mit 1 % Casaminosäuren, gezüchtet. Die Zeit wird in Minuten angegeben. Weiße Pfeile zeigen Septen an. Maßstabsbalken, 5 μm. d Unvollständige Septumbildung in ΔsppA, visualisiert mit FM4-64. Weiße Pfeile zeigen Septen an. Maßstabsbalken, 5 μm. e Ausgetretene zytoplasmatische Bestandteile in ΔsppA beim Platzen der Hyphenspitze infolge eines hypotonen Schocks. Weiße Pfeilspitzen weisen auf ausgetretene zytoplasmatische Bestandteile an der Hyphenspitze hin. Maßstabsbalken, 20 μm. f Abnormale Anbindung von Woronin-Körpern an das unvollständige Septum in ΔsppA. Gezeigt werden einzelne konfokale Fluoreszenzbilder an den apikalen Septen. Weiße Pfeile zeigen Septen an. Maßstabsbalken, 5 μm.

Bei normalem Wachstum wurden 49 Proteine ​​anhand ihrer Septumlokalisation in drei Kategorien eingeteilt: (1) um die Septumpore herum (Abb. 3a und ergänzende Abb. 4a), (2) auf beiden Seiten des Septums (Abb. 3b und ergänzende Abb. 4a). Abb. 4b) und (3) entlang des Septums (Ergänzende Abb. 4c).

Die erste Kategorie wurde weiter in zwei Untergruppen unterteilt: ringförmige Lokalisierung, als zwei Punkte um die Septumpore unter konfokaler Mikroskopie (26 Proteine); und fokale Lokalisierung im Zentrum der Septumpore (acht Proteine) (Abb. 3a und ergänzende Abb. 4a).

Dreizehn Proteine ​​waren auf beiden Seiten des Septums in der Nähe der Septumpore vorhanden, ähnlich der Position des Woronin-Körpers (Abb. 3b und ergänzende Abb. 4b). SppF und SppM zeigten eine punktförmige Lokalisierung auf beiden Seiten, parallel zur Septumpore. Die verbleibenden Proteine ​​​​unter dieser Kategorie waren jedoch weitgehend auf beiden Seiten mit mehreren Puncta lokalisiert (Abb. 3b und ergänzende Abb. 4b). SppF-EGFP kolokalisierte mit mCherry-markiertem Woronin-Körpermatrixprotein AoHex1 am Septum und im Zytoplasma (ergänzende Abbildung 5a). Die Lokalisierung des Woronin-Körpers im Septum war jedoch unabhängig von SppF (ergänzende Abbildung 5b). Zwei Proteine ​​waren in der dritten Kategorie entlang des Septums, jedoch nicht peripher entlang der Hyphen lokalisiert (ergänzende Abbildung 4c).

Die miteinander verbundene Anordnung von Hyphenzellen ist anfällig für mechanische Verletzungen, die ohne Verstopfung der Septumporen zu einem erheblichen Zytoplasmaverlust führen10,12,16,22,23. Bei einer Verletzung sammeln sich eine Reihe zytoplasmatischer Proteine ​​in der Septumpore an10,15,16. Daher wurden alle 776 EGFP-Fusion-exprimierenden Stämme einer durch hypotonen Schock verursachten Hyphenverletzung ausgesetzt10,16,22,23. Interessanterweise wurde festgestellt, dass sich 13 Proteine, die unter normalen Wachstumsbedingungen zytoplasmatische (fünf Proteine), organellenartige (vier Proteine) und Hyphenspitzenlokalisationen (vier Proteine) zeigten, bei der Verletzung an der Septumpore ansammelten (Abb. 3c und ergänzende Abb. 4d). ). Darüber hinaus zeigten SppI, SppT und SppL, die sich um die Septumpore herum befanden, sowie SppO und SppF, die sich bei normalem Wachstum auf beiden Seiten des Septums befanden, bei der Verletzung eine konzentrierte Lokalisierung in der Septumpore (ergänzende Abbildung 4e). . Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass es sich hierbei um Kandidatenproteine ​​mit Funktionen als Reaktion auf Verletzungen handelte, wie es auch für die septalporenakkumulierenden Proteine ​​berichtet wurde15,16,17.

Bei Tieren induziert eine mechanische Verletzung eine dynamische Umgestaltung der Membranfunktion über Mechanismen wie die Fusion sekretorischer Vesikel mit der Plasmamembran, um die Heilung zu fördern28. Pezizomycotina nutzt den Woronin-Körper, um bei einer Verletzung die Septumpore zu verstopfen12. Hier wurde die Porenverstopfungsaktivität des Septums nach der Deletion von 62 Kandidatengenen durch Ersetzen durch den selektierbaren Marker pyrG analysiert. Vier Deletionen zeigten ein verringertes Koloniewachstum (ergänzende Abbildung 6a). Die Deletionsstämme wurden dann einem hypotonen Schock ausgesetzt, der zu einer Verletzung der Hyphenspitze führte (Abb. 4a)10,16,22,23. Hyphen, die vor übermäßigem Zytoplasmaverlust der benachbarten Zellen geschützt waren, wurden mittels Differential-Interferenz-Kontrastmikroskopie gezählt (Abb. 4a).

Insgesamt zeigten 23 (37 %) Deletionsstämme im Vergleich zur Wildtyp-Kontrolle eine deutlich verringerte Fähigkeit, flankierende Zellen vor übermäßigem Zytoplasmaverlust bei Verletzung zu schützen (Abb. 4b), was auf eine beeinträchtigte Septumporenverstopfung hinweist. Bemerkenswert ist, dass die Deletion von sppA den Verlust des Zytoplasmas nicht verhinderte (Abb. 4b). Diese Unfähigkeit wird möglicherweise durch einen Defekt in der Septumbildung verursacht, da SppA-EGFP vorübergehend an der Stelle der Septumbildung auftrat, ähnlich wie beim Zusammenbau und der Verengung des kontraktilen Aktinrings (Abb. 4c). SppA, das die C2-Domäne besitzt, ist das Ortholog von Inn1 und Fic1 in Knospungs- bzw. Spalthefen (ergänzende Abbildung 8a), die beide für das Eindringen in die Plasmamembran während der Zytokinese essentiell sind . Da die Septumbildung bei Pezizomycotina der Zytokinese entspricht, haben wir die Septummorphologie in ΔsppA untersucht. Wildtyp-Kontrollen zeigten scheibenförmige Wände, die die Hyphen aufteilten (Abb. 4d). Im Gegensatz dazu zeigte ΔsppA abnormale Septen mit unvollständigem Eindringen der Plasmamembran aus dem Kortex (Abb. 4d). Bei einer Hyphenverletzung trat ein größeres Volumen an zytoplasmatischen Bestandteilen aus kontinuierlich verbundenen Zellen in ΔsppA aus (Abb. 4e). Darüber hinaus waren Woronin-Körper in ΔsppA abnormal an das unvollständige Septum am Hyphenkortex gebunden (Abb. 4f).

Das Fehlen von SppB, SppC, SppD, SppE und SppF erhöhte den Zytoplasmaverlust über die Septumpore im Vergleich zum Wildtyp-Stamm (Abb. 4b), was auf die funktionelle Relevanz dieser Proteine ​​bei der Verstopfung der Septumporen bei Verletzungen hinweist. Die Expression von EGFP-Fusionsproteinen schwächte den septalen Porenverstopfungsdefekt der entsprechenden Gendeletionen ab (ergänzende Abbildung 6b), was bestätigt, dass die Fusionen funktionsfähig sind. Anschließend haben wir Woronin-Körper im Hintergrund der Gendeletion sichtbar gemacht und festgestellt, dass sie an das Septum gebunden blieben (ergänzende Abbildung 5b), was darauf hindeutet, dass ihre Anbindung unabhängig von den SPP-Proteinen erfolgt. Allerdings schienen mehr als die Hälfte der 62 analysierten Proteine ​​keine signifikante Rolle bei der Verstopfung der Septumporen nach einer Verletzung zu spielen.

Um funktionelle Beziehungen zwischen SPP-Proteinen zu untersuchen, haben wir Stämme mit doppelter Deletion erzeugt. Repräsentative Gene sppG, sppF und sppE wurden aus Lokalisierungskategorien ausgewählt; um die Septumpore, auf beiden Seiten des Septums bzw. Septumporenansammlung. Die ausgewählten repräsentativen Gene wurden im Löschhintergrund eines anderen Gens unter derselben Lokalisierungskategorie gelöscht. Nach der Hyphenverletzung zeigte keine der Doppeldeletionen mit Ausnahme von ΔsppGΔsppA eine weitere Verringerung der Verstopfung der Septumporen im Vergleich zu der Einzeldeletion (ergänzende Abbildung 6c). Darüber hinaus zeigten die Einzeldeletionen einen messbaren Phänotyp, wohingegen die entsprechenden Doppeldeletionen keine weiteren Mängel bei der Verstopfung der Septumporen aufwiesen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass jedes SPP-Protein eine nicht überlappende Rolle spielte und nicht vollständig durch ein anderes ersetzt werden konnte.

Da sich die Septumpore unter Stress schließt10,11, wurden 62 Stämme, die die mit EGFP markierten septumlokalisierenden Proteine ​​exprimieren, Kältestress (4 °C) ausgesetzt, um ihr dynamisches Verhalten an der Septumpore zu bewerten. Interessanterweise wurden vier SPP-Proteine, die normalerweise im Zytoplasma lokalisiert sind, unter Kältestress in der Septumpore beobachtet (Abb. 5a). SppB, SppE und SppN sammelten sich in der Septumpore beider flankierender Zellen an, während SppC als Puncta in der Mitte der Septumpore vorhanden war (Abb. 5a). Die Lokalisierung von SppJ in der Septumpore wurde durch Kältestress gefördert (Abb. 5a).

a Lokalisierung von SPP-EGFP-Fusionsproteinen. Schwarz/weiße Pfeile zeigen Septen an und rosa Pfeilspitzen zeigen die Ansammlung von Septumporen an. Es werden einzelne konfokale Fluoreszenzbilder angezeigt. Maßstabsbalken, 5 μm. b Modelle für die Photoaktivierung und den Zell-zu-Zell-Transfer von Dendra2 (links); Quantifizierung der Übertragung (rechts). Maßstabsbalken, 10 μm. Der Dendra2-Transfer durch die Septumpore wurde in jedem Experiment an zehn zufällig ausgewählten apikalen Septen überwacht. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt und der Prozentsatz der offenen Septumporen ist auf der Y-Achse dargestellt. Die Daten werden als Mittelwert wiederholter Experimente dargestellt und Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des zweiseitigen Student-t-Tests getestet: *P < 0,05, **P < 0,01. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Der Status der Zell-zu-Zell-Konnektivität in den Gen-Deletion-Hintergründen ohne 62 Septumproteine ​​wurde unter Kältestress überwacht, indem der Zell-zu-Zell-Transfer von Dendra2, einem grün-in-rot photokonvertierbaren fluoreszierenden Protein10, verfolgt wurde (Abb. 5b, links). ). In Wildtyp-Kontrollen wurde die rote Fluoreszenz von photokonvertiertem Dendra2 über die Septumpore auf benachbarte Zellen übertragen, diese Übertragung war jedoch bei 4 °C drastisch verringert (Abb. 5b, rechts). Im Gegensatz dazu war die Diffusion von Dendra2 in ΔsppA sowohl bei normalen als auch bei kalten Temperaturen überhaupt nicht eingeschränkt (Abb. 5b, rechts), was auf eine kontinuierliche Konnektivität von Zelle zu Zelle hinweist, die durch unvollständige Septumbildung verursacht wird (Abb. 4d). Die Stämme ΔsppB, ΔsppE und ΔsppC ermöglichten weiterhin den Dendra2-Transfer bei niedrigen Temperaturen (Abb. 5b, rechts), was auf eine teilweise abweichende Regulierung der Septumporenfunktion bei Kältestress hinweist.

Eine große Anzahl septaler Proteine, darunter auch SPP-Proteine, sind mit einer winzigen subzellulären Stelle, der Septumpore, assoziiert. Als nächstes haben wir geklärt, ob SPP-Proteine ​​​​spezielle Sequenzen oder Strukturmerkmale besitzen, die sie mechanisch zum Septum leiten, wie für die ungeordnete Region der SPA-Proteine ​​von N. crassa berichtet17. Zunächst analysierten wir mithilfe von IUPred2A31 den Grad und die Verteilung der in den SPP-Proteinen vorhandenen ungeordneten Regionen. Dreizehn der 23 SPP-Proteine ​​besitzen Sequenzen mit hoher Wahrscheinlichkeit einer intrinsischen Störung (Abb. 6 und ergänzende Abb. 7a, b). Typischerweise waren die auf beiden Seiten des Septums lokalisierten SPP-Proteine ​​strukturell geordnet, während diejenigen, die sich um die Septumpore herum lokalisierten oder sich dort ansammelten, größtenteils ungeordnet waren (Abb. 6 und ergänzende Abb. 7b). Um die Bedeutung der gestörten Region bei der Septumlokalisierung zu untersuchen, exprimierten wir EGFP-markierte verkürzte Varianten. Interessanterweise waren die ungeordneten N-Termini sowohl von SppB als auch von SppD ausreichend und für die Ansammlung im Septum nach einer Verletzung essentiell (Abb. 6a). Ungeordnete Regionen, die prolinreiche Domänen enthalten, sind wichtig für die Proteinaggregation im Phasentrennungsverhalten32,33. Neben SppB neigte die SppN-Sequenz dazu, über ihre gesamte Länge ungeordnete Regionen aufzuweisen, und enthielt konservierte prolinreiche Motive in den N-terminalen Resten 1–265 (ergänzende Abbildung 7c, d), die für die Wundinduktion ausreichend und erforderlich waren septale Ansammlung (Abb. 6a). Im Gegensatz dazu waren bei SppP, SppI, SppL und SppW sowohl die geordneten als auch die ungeordneten Regionen für ihre normale Septumlokalisation wesentlich (Abb. 6b). Insgesamt ist die gestörte Region wichtig für die wundbedingte Septumansammlung und die normale Septumlokalisation.

a Drei SPP-Proteine, die bei Verletzung der Hyphen eine Ansammlung von Septumporen zeigten, beherbergten eine beträchtliche Länge einer ungeordneten Region, die von der geordneten Region getrennt war. b Vier SPP-Proteine ​​waren rund um die Septumpore lokalisiert und beherbergten eine beträchtliche Länge der ungeordneten Region, getrennt von der geordneten Region. Die Grafiken zeigen die Vorhersage ungeordneter Regionen mithilfe von IUPred2A. Die Y-Achse gibt die vorhergesagte Wahrscheinlichkeit einer Störung an und die X-Achse stellt die Aminosäuresequenz dar. In der fluoreszenzmikroskopischen Analyse wurden vollständige und verkürzte Varianten von EGFP-fusionierten SPP-Proteinen im entsprechenden Deletionshintergrund exprimiert. Die Stämme wurden 18 Stunden lang in CD-Medium, ergänzt mit 1 % Casaminosäuren, gezüchtet. Es werden einzelne konfokale Fluoreszenzbilder angezeigt. Pfeile zeigen apikale Septen und rote Pfeilspitzen zeigen die Ansammlung von Septumporen an. Maßstabsbalken, 5 μm. ODER bestellt, DO ungeordnet.

Als nächstes analysierten wir die ungeordneten Regionen hinsichtlich der Aminosäurezusammensetzung und verglichen sie mit denen von N. crassa SPA-Proteinen und ungeordneten Proteinen/Regionen aus dem DisProt-Datensatz sowie den ungeordneten Proteinen aus Phenylalanin/Glycin (FG)-Repeat Nukleoporine (FG-Nups) und Serin/Arginin (SR)-Wiederholungsspleißfaktoren. Die ungeordneten Regionen sowohl der SPP- als auch der SPA-Proteine ​​zeigten Vorurteile gegenüber Arginin und Histidin, zeigten jedoch Antipathien gegenüber Lysin und Glycin im Vergleich zu FG-Nukleoporinen, SR-Spleißfaktoren und den ungeordneten Proteinen/Regionen aus dem Disprot-Datensatz (ergänzende Abbildung 7e).

Wir analysierten die phylogenetische Verteilung und den Grad der Divergenz von SPP-Proteinen im Vergleich zu umfassenden Daten von Proteinsequenzen, die von repräsentativen Arten gewonnen wurden, die alle wichtigen Pilzstämme und -unterstämme abdecken. Dementsprechend haben wir Arten aus Subphyla innerhalb der Ascomycota (Taphrinomycotina, Saccharomycotina und Pezizomycotina) und Basidiomycota (Agaricomycotina, Pucciniomycotina und Ustilaginomycotina) sowie Vertreter früher divergierender Abstammungslinien, Mucoromycota, Zoopagomycota, Chytridiomycota, Blastocladiomycota und Cryptomycota (Rozellomycota), ausgewählt. 20,34. Aufgrund ihrer hohen Evolutionsrate35 wurden Mikrosporidien von dieser Analyse ausgeschlossen. Zunächst wurden die Proteomdaten von 81 Pilzarten mithilfe von OrthoFinder36 in orthologe Gruppen kategorisiert. Anschließend wurden die Substitutionsraten orthologer Proteine ​​in Pilzphyla / Subphyla aus der Pezizomycotina-Wurzel auf der Grundlage phylogenetischer Bäume mit maximaler Wahrscheinlichkeit berechnet (Abb. 7 und ergänzende Daten 5a – c). Um orthologe Beziehungen weiter zu verifizieren, wurden SPP-Protein-Phylogenien für jede orthologe Gruppe erstellt (Ergänzende Abbildungen S8 und 9). Zusammen mit phylogenetischen Analysen wurden SPP-Proteine ​​schließlich in zwei evolutionäre Gruppen eingeteilt; (1) diejenigen mit Orthologen außerhalb von Pezizomycotina und (2) diejenigen, die speziell in Pezizomycotina vorhanden sind (Abb. 7).

Aminosäuresubstitutionen pro Standort werden in Blau als Heatmap angezeigt. Gefüllte und leere Farben kennzeichnen entsprechend den Ergebnissen von OrthoFinder das Vorhandensein bzw. Fehlen orthologer Proteine. Der phylogenetische Baum wurde unter Verwendung der orthologen Gruppenproteine ​​erstellt, wobei in fast allen Arten ein einziges Ortholog vorhanden war. Die Skala links in den Modellen der SPP-Proteinstrukturen stellt die Anzahl der Aminosäuren dar. ND keine Domain.

Dreizehn Proteine ​​(SppA, SppC, SppR, SppD, SppJ, SppU, SppE, SppH, SppP, SppL, SppV, SppB und SppK) zeigten Orthologe außerhalb von Pezizomycotina. Unter ihnen besaßen SppA, SppC und SppR Orthologe in Ascomycetenhefen ohne Septumporen, Saccharomycotina und Taphrinomycotina, in derselben Gruppe. SppA enthält die C2-Domäne (PF00168)37 und gehört zu einer breiten orthologen Gruppe, die Inn1 und Fic1 aus Knospungs- bzw. Spalthefen umfasst (Abb. 7 und ergänzende Abb. 8a). SppC besitzt eine N-terminale CUE-Domäne (PF02845)38, eine C-terminale SMR-Domäne (PF01713)39 und eine DUF1771-Domäne (SM001162)40. Ähnlich wie SppA gehört SppC zu einer breiten orthologen Gruppe (Abb. 7 und ergänzende Abb. 8b). SppR wurde mit dem peroxisomalen Membranprotein Pex8 aus einigen Pilzarten gruppiert (Abb. 7 und ergänzende Abb. 8c).

SppD, SppJ und SppU wiesen innerhalb ihrer orthologen Gruppen mehrere Unterklassen auf, einschließlich Pezizomycotina. SppD besitzt drei Wiederholungen der SEL1-Domäne (SM00671)41 und bildet eine Pezizomycotina-spezifische Subklasse innerhalb der großen Gruppe, einschließlich anderer orthologer Pilzproteine ​​(Abb. 7 und ergänzende Abb. 8d). SppJ enthält eine DnaJ-Domäne (PF00226)42 und bildet eine Pezizomycotina-spezifische Unterklasse in der Nähe einiger Arten von Chytridiomycota und Mucoromycota (Abb. 7 und ergänzende Abb. 8e). SppU enthält eine FMO-ähnliche Domäne (PF00743)43 und bildet eine Unterklasse, die Pezizomycotina und eine begrenzte Anzahl von Ustilaginomycotina-, Taphrinomycotina- und Chytridiomycota-Arten umfasst (Abb. 7 und ergänzende Abb. 8f).

Darüber hinaus zeigten die Proteine ​​SppE, SppH, SppP, SppL und SppV orthologe Beziehungen zu anderen Pilzstämmen/-unterstämmen, einschließlich der Ascomyceten-Hefen Taphrinomycotina. SppE enthält eine pflanzenbezogene Seneszenzdomäne (PF06911)44 und gehört zu einer orthologen Gruppe, einschließlich Basidiomycota, früh divergierenden Pilzen und Taphrinomycotina (Abb. 7 und ergänzende Abb. 8g). SppH und SppP, die keine bekannten Domänen besitzen, hatten orthologe Beziehungen zu Proteinen früher divergierender Pilze und einiger Arten von Taphrinomycotina (Abb. 7 und ergänzende Abb. 8h, i). SppL und SppV, wobei letzteres eine Aim21-Domäne (PF11489)45 beherbergt, zeigten orthologe Beziehungen zu einer begrenzten Anzahl von Arten aus Taphrinomycotina (Abb. 7 und ergänzende Abb. 8j, k).

SppB und SppK zeigten auch Orthologe außerhalb von Pezizomycotina, jedoch nicht in einer der Ascomyceten-Hefen. SppB, das eine Transglut_core-Domäne (PF01841)46 enthält, gehörte zu einer orthologen Gruppe, die einige Arten von Chytridiomycota, Mucoromycota und Agaricomycotina umfasst (Abb. 7 und ergänzende Abb. 8l). SppK zeigte nur mit einigen Arten aus Agaricomycotina eine orthologe Beziehung (Abb. 7 und ergänzende Abb. 8m).

Als andere Gruppe wurden insgesamt zehn SPP-Proteine ​​als Pezizomycotina-spezifisches Vorkommen identifiziert. Neun SPP-Proteine, darunter SppF, SppG, SppI, SppM, SppN, SppO, SppS, SppT und SppW, enthalten keine Domänen, weisen jedoch keine orthologen Beziehungen zu anderen Pilzstämmen und -unterstämmen auf (Abb. 7 und ergänzende Abb. 9a-i). ). SppQ enthält eine 14-3-3-Domäne (PF00244)47 und gehört zu einer orthologen Gruppe, die nur Pezizomycotina-Arten umfasst, die sich von einer anderen Gruppe unterscheidet, die dieselbe Domäne enthält (Abb. 7 und ergänzende Abb. 9j). Diese SPP-Proteine ​​sind mit Ausnahme von SppN und SppS in Pezizomycotina häufig konserviert (Abb. 7).

Trotz unseres auf Bioinformatik basierenden Screenings zur Auswahl von Genen, die in Ascomyceten-Hefen fehlen oder abweichen (Abb. 1b), enthalten zwei SPP-Proteine, SppA und SppC, jeweilige Hefeorthologe innerhalb derselben Kladen (ergänzende Abb. 8a, b). Daher wurden diese Proteine ​​anhand ihrer strukturellen Unterschiede funktionell analysiert.

SppA besitzt eine N-terminale C2-Domäne, die in den orthologen Pilzproteinen konserviert ist. Die Länge des C-Terminus variiert jedoch zwischen den orthologen Proteinen und ist bei Pezizomycotina-Arten länger als bei Ascomyceten-Hefen und anderen Pilzen (Abb. 8a). Um die funktionelle Bedeutung einzelner Regionen zu verdeutlichen, wurden verkürzte Varianten von SppA als EGFP-Fusionen im ΔsppA-Hintergrund exprimiert. Ihre Expressionsniveaus waren denen des SppA voller Länge ähnlich (ergänzende Abbildung 10a, links). Eine SppA-Variante (Reste 128–912), der die N-terminale Region zusammen mit der C2-Domäne fehlt, konnte weder die Septumbildung abschließen noch einen übermäßigen Zytoplasmaverlust bei Hyphenverletzung verhindern (Abb. 8b, d). Darüber hinaus lokalisierte diese Variante nicht das Septum (ergänzende Abbildung 10b), was mit der bekannten Funktion des Membran-Targetings durch die C2-Domäne 37 übereinstimmt. In ähnlicher Weise konnten SppA-Verkürzungen ohne C-Terminus (Reste 1–127 und 1–476) den durch die sppA-Deletion verursachten Septumporendefekt-Phänotyp nicht abschwächen (Abb. 8b, d), was darauf hinweist, dass diese Regionen für eine ordnungsgemäße Septumbildung erforderlich sind und Septumporenverstopfung. Als nächstes fusionierten wir die N-terminale Region von SppA zusammen mit der C2-Domäne von A. oryzae und der C-terminalen Region von A. nidulans und N. crassa, die Septumporen tragen, sowie von S. pombe, die keine Septalporen aufweisen (Abb. 8c). EGFP-Fusionen dieser chimären Konstrukte wurden ähnlich wie SppA voller Länge exprimiert (ergänzende Abbildung 10a, links). Chimäre Proteine, die die C-Termini von A. nidulans [SppA(AO + AN)] und N. crassa [SppA(AO + NC)] enthielten, retteten die septalporendefekten Phänotypen vollständig bzw. teilweise (Abb. 8c, d). . Im Gegensatz dazu wies das Konstrukt mit dem C-Terminus des S. pombe-Orthologen Fic1 [SppA(AO + SP)] einen ähnlichen Defekt wie ΔsppA auf (Abb. 8c, d), was darauf hindeutet, dass das Hefeprotein nicht vollständig funktionsfähig ist Ortholog von SppA. Daher kamen wir zu dem Schluss, dass die erweiterte C-terminale Region von SppA septumbezogene Funktionen bereitstellte und dass sich die Region in der Abstammungslinie, die zu Pezizomycotina führt, diversifizierte, bei Ascomyceten-Hefen jedoch verkürzt war.

a, e Längen von SppA und SppC mit ihren Pilzorthologen. Rosa, blaue, schwarze und grüne Texte weisen jeweils auf Arten von Pezizomycotina, Ascomyceten-Hefen, Basidiomyceten und früh divergierenden Pilzen hin. Balken stellen bekannte Proteindomänen dar. Die Anzahl der Aminosäurereste wird in der Skala oben angezeigt. b Sowohl die N- als auch die erweiterten C-terminalen Regionen von SppA sind für die normale Septumbildung unerlässlich. Apikale Septen wurden mit dem Farbstoff FM4-64 sichtbar gemacht. c Septa in Stämmen, die chimäre SppA-Proteine ​​exprimieren, wobei der N-Terminus zusammen mit der C2-Domäne von A. oryzae stammt und der C-Terminus von den Septumporen tragenden oder fehlenden Ascomyceten stammt. AO Aspergillus oryzae, AN Aspergillus nidulans, NC Neurospora crassa, SP Schizosaccharomyces pombe. Septen wurden mit dem Farbstoff FM4-64 sichtbar gemacht. SppA(AO + NC) rettete die fehlerhaften Phänotypen in bemerkenswertem Maße, und es werden die beiden typischen Bilder einer normalen und einer abnormalen Septumbildung gezeigt. Maßstabsbalken, 5 μm. d, g Schutz flankierender Zellen vor Zytoplasmaverlust bei Hyphenverletzung. In jedem Experiment wurden dreißig zufällig ausgewählte Hyphen beobachtet, die ein Aufplatzen der Hyphenspitze zeigten. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt und auf der Y-Achse ist der Prozentsatz der Hyphen dargestellt, die vor dem übermäßigen Zytoplasmaverlust geschützt waren. Die Daten werden als Mittelwert wiederholter Experimente dargestellt und Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des zweiseitigen Student-t-Tests getestet: **P < 0,01. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. f Der N-Terminus von SppC ist für die Akkumulation in der Septumpore bei einer Hyphenverletzung von wesentlicher Bedeutung. Es werden einzelne konfokale Fluoreszenzbilder angezeigt. Weiße Pfeile zeigen Septen an, und rote Pfeilspitzen repräsentieren die Lokalisierung der Septumporen. Maßstabsbalken, 5 μm.

SppC besitzt eine N-terminale CUE-Domäne, die eine Diversität der Domänenpräsenz oder -fehlens unter ihren Orthologen aufweist (Abb. 8e und ergänzende Abb. 8b). Das Alignment mehrerer Sequenzen ergab eine Diversität der MFP-Motive, jedoch die Erhaltung des LL-Motivs (ergänzende Abbildung 11), die beide für die hochaffine Bindung mit Ubiquitin erforderlich sind 48, 49. Um die Regionen zu identifizieren, die für die auf Septumporen gerichtete Akkumulation verantwortlich sind, wurden Verkürzungen von SppC als EGFP-Fusionen im ΔsppC-Hintergrund ausgedrückt. Ihre Expressionsniveaus waren denen des SppC voller Länge ähnlich (ergänzende Abbildung 10a, rechts). Die N-terminalen 185 Reste, die die CUE-Domäne enthielten, reichten für die Akkumulation an der Septumpore bei der Verletzung aus, ähnlich wie beim Volllängenprotein, wohingegen die Verkürzung der N-terminalen 142 Reste diese Reaktion verhinderte (Abb. 8f). Allerdings akkumulierten nur die N-terminalen 142 Reste ohne die CUE-Domäne nicht eindeutig an der Septumpore (Abb. 8f), was darauf hindeutet, dass die N-terminalen 142 Reste essentiell, aber nicht ausreichend sind, um sich an der Septumpore anzusammeln. Ein längeres N-terminales Konstrukt (Reste 1–185), das die CUE-Domäne enthielt, rettete den septalporendefekten Phänotyp des ΔsppC vollständig (Abb. 8g). Zwei andere verkürzte SppC-Varianten (Reste 143–556 und Δ143–185 ohne CUE-Domäne) konnten den defekten Phänotyp nicht retten (Abb. 8g). Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass ein vollständiger N-Terminus einschließlich der CUE-Domäne für die septale Porenfunktion von SppC wesentlich ist.

Zusammengenommen liefern diese Ergebnisse Hinweise darauf, dass Pezizomycotina-spezifische Merkmale, wie der verlängerte C-Terminus von SppA und die N-terminale Region von SppC, für die Septumfunktion wichtig sind.

In dieser Studie haben wir zwei morphologisch unterschiedliche Pilzgruppen verglichen, um die genetischen Innovationen, die zur Entwicklung der Pilzseptumpore und ihrer Regulierung führen, besser zu verstehen. Beim Lokalisierungsscreening wurden zahlreiche funktionell wichtige Septumproteine ​​identifiziert, die in den Hefen ohne Septumporen entweder fehlten oder divergent waren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Pezizomycotina mindestens 23 SPP-Proteine ​​entwickelt hat, die entweder als solche mit Orthologen außerhalb von Pezizomycotina oder als solche, die speziell in Pezizomycotina vorhanden sind, für die Septumporenregulierung gegen widrige Bedingungen wie Verletzungen und Kältestress klassifiziert werden.

Obwohl groß angelegte Lokalisierungsscreenings zuvor als leistungsstarker umgekehrter genetischer Ansatz bei Tieren50, Hefen25,26 und Bakterien51 eingesetzt wurden, haben wir diese Strategie in der vorliegenden Studie zum ersten Mal bei Fadenpilzen eingesetzt. An der Hyphenspitze lokalisierte Proteine ​​​​wurden seltener gefunden als am Septum (Abb. 2b und ergänzende Abb. 3b). Dies könnte daran liegen, dass einige Ascomyceten-Hefen, einschließlich der für unser bioinformatisches Screening verwendeten Arten (Abb. 1b), ein Pseudohypen- oder Hyphenwachstum erfahren können52. Daher hat Pezizomycotina nicht viele Proteine ​​entwickelt, die speziell beim Wachstum der Hyphenspitze eine Rolle spielen. Fünf der Hyphenspitzenproteine ​​waren auch im Septum/Septumporen lokalisiert (Abb. 2b und ergänzende Abb. 3b), ähnlich wie mehrere bekannte Septumproteine10,24. Von diesen zeigten drei Deletionsstämme, denen solche Proteine ​​​​fehlten, im Vergleich zum Wildtyp-Stamm ein verringertes Koloniewachstum (ergänzende Abbildung 6a; mit Ausnahme von SppA), was auf ihre Beteiligung an der Hyphenmorphogenese schließen lässt. Die Bildung perforierter Septen ist evolutionär spezifisch für mehrzellige Pilze und kam nur bei diesen vor. Über die Hälfte unserer identifizierten Septumproteine ​​(34/62) zeigten eine Lokalisierung um die Septumpore (Abb. 3a und ergänzende Abb. 4a), was möglicherweise zur Aufrechterhaltung der Septumporenstruktur beitrug.

Fadenpilze haben mehrzellige Wundmanagementsysteme entwickelt. Die septierten Unterstämme Pezizomycotina und Agaricomycotina verfügen über den Woronin-Körper bzw. die septale Porenkappe, um das Austreten von Zytoplasma bei Verletzungen zu begrenzen12,13,14. Im Gegensatz dazu weist der aseptierte Stamm Mucoromycota eine protoplasmatische Gelierung auf53. In dieser Studie ergab die quantitative Analyse geschützter Hyphen nach Verletzung, dass mehr als ein Drittel (23/62) der in Frage kommenden Septumproteine ​​an der Verstopfung der Septumporen beteiligt waren (Abb. 4b). Doppelte Deletionen der spp-Gene verursachten keine weiteren Defekte bei der Verstopfung der Septumporen (ergänzende Abbildung 6c), die bei der Deletion von Aohex1, das für ein Woronin-Körpermatrixprotein kodiert, nicht das schwerwiegende Defektniveau erreichten (Abb. 4b). Woronin-Körper, in denen das Hex1-Protein den kristalldichten Kern bildet, der größer als die Septumpore ist, um dem durch die Wunde verursachten Turgordruck standzuhalten, spielen eine Hauptrolle bei der Porenverstopfungsfunktion. Allerdings erfordert das körpervermittelte Woronin-Verstopfen möglicherweise eine erneute Versiegelung der Plasmamembran, um den Wundheilungsprozess für die anschließende Wiederaufnahme des Wachstums abzuschließen. Ein Teil der SPP-Proteine, die sich in der Septumpore ansammelten (Abb. 6a), weist ungeordnete Merkmale mit Aminosäurezusammensetzungen auf, die denen von N. crassa SPA-Proteinen 17 (ergänzende Abb. 7e) gemeinsam sind. Ungeordnete Regionen der SPP-Proteine ​​waren wichtig für die Septumakkumulation nach einer Verletzung (Abb. 6a), und die Aggregationseigenschaften der ungeordneten Regionen der N. crassa SPA-Proteine ​​lassen auf eine Funktion zur Konsolidierung von Woronin-Körpern mit Septumporen schließen17. Zusammengenommen legen diese Aspekte nahe, dass SPP-Proteine ​​zusammen mit N. crassa-SPAs eine untergeordnete Rolle bei der Verstopfung der Septumporen spielen.

Eine weitere Charakterisierung der in mehreren SPP-Proteinen vorhandenen funktionellen Domänen wird dazu beitragen, die konvergente Entwicklung regulatorischer Komponenten/Mechanismen für die Konnektivität von Zelle zu Zelle, einschließlich Gap Junctions, Plasmodesmen und Septumporen, zu untersuchen. SppA besitzt die C2-Domäne, die an der Verankerung an Plasmodesmen beteiligt ist55. Die SppC-CUE-Domäne besitzt konservierte Ubiquitin-bindende MFP- und LL-Motive 48, 49 (ergänzende Abbildung 11). Das Gap-Junction-Protein Cx43 erfährt bei abiotischem Stress einen Ubiquitin-vermittelten Abbau56, was darauf hindeutet, dass Ubiquitinierung der gemeinsame biochemische Prozess sein könnte, der die Zell-zu-Zell-Konnektivität bei Pilzen und Tieren reguliert.

Die Konnektivität von Zelle zu Zelle über Gap Junctions56, Plasmodesmen8 und Septumporen10 kann als Reaktion auf biotischen und abiotischen Stress blockiert werden. In dieser Studie wurde der Status der Zell-zu-Zell-Konnektivität als Reaktion auf Kältestress quantitativ analysiert (Abb. 5b). Ein Stamm ohne SppA zeigte selbst unter Kältestress aufgrund einer fehlerhaften Septummorphologie eine uneingeschränkte Übertragung von Dendra2 von Zelle zu Zelle (Abb. 5b). Drei SPP-Proteine ​​(SppB, SppC und SppE) hatten eine Funktion bei der Verstopfung der Septumporen sowohl bei Verletzung als auch bei Kältestress (Abb. 4b und 5b), was auf eine gemeinsame Stressreaktionsmaschinerie schließen lässt. Im Allgemeinen reagierten SPP-Proteine ​​weniger auf Kältestress als auf Hyphenverletzungen (Abb. 4b und 5b), was darauf hindeutet, dass sie überwiegend am Schutz flankierender Zellen vor wundbedingtem Zytoplasmaverlust beteiligt sind.

Laut der orthologen Gruppe und phylogenetischen Analysen haben 13 SPP-Proteine ​​Orthologe außerhalb von Pezizomycotina (Abb. 7). Insbesondere bei den SPP-Proteinen mit Orthologen aus frühen divergierenden Pilzen liegen ihre Ursprünge vor der Entstehung der Septumpore, was auf eine Kooptierung der bereits vorhandenen Gene für die Septumporenregulation hindeutet. Unser auf Bioinformatik basierendes Screening war ursprünglich darauf ausgelegt, Gene zu identifizieren, die in Hefen ohne Septumporen divergent waren oder fehlten (Abb. 1b). Entgegen unserem Ziel zeigten 12 SPP-Proteine ​​orthologe Beziehungen zu denen der septalporenlosen Spezies aus Ascomyceten-Hefen und früh divergierenden Pilzen (Abb. 7 und ergänzende Abb. 8). Dieser Befund wirft eine grundlegende Frage hinsichtlich der prinzipiellen und allgemeinen Funktionen dieser Proteine ​​auf. SppA weist eine Verlängerung am C-Terminus in Pezizomycotina auf (Abb. 8a), die evolutionär spezifisch für die Bildung des porösen Septums sein könnte. Die Hefe-Zytokinese unterscheidet sich morphologisch von der von Pezizomycotina, da Hefe-Tochterzellen durch SppA-Orthologe vollständig von der Mutter getrennt sind29,30. In diesem Szenario kann die Unfähigkeit der sppA-Deletionsmutante, die Septumpore zu verstopfen, durch eine fehlerhafte Zytokinese oder Septumbildung erklärt werden. Nif1 und Dsf2 sind Orthologe von SppD in Spalt- bzw. Knospenhefen (ergänzende Abbildung 8d). Nif1 wirkt über die Interaktion mit der Nim1-Proteinkinase57 als mitotischer Inhibitor, während sich Dsf2 am Knospenhals58, dem Ort der Zytokinese, lokalisiert. Dies deutet auf eine mögliche Rolle von SppD bei der Regulierung des Zellzyklus oder der Zytokinese hin. Die SppD-Subklasse unterscheidet sich von einer anderen Subklasse, die Pezizomycotina- und Hefeorthologe enthält (ergänzende Abbildung 8d). Daher nehmen wir an, dass sich SppD in Pezizomycotina durch Genduplikation entwickelt hat, um Funktionen im Zusammenhang mit Septumporen auszuführen. Daher bedarf die funktionelle Rolle von SppD bei der Bildung poröser Septen weiterer Untersuchungen.

SppC besitzt eine funktionell wichtige N-terminale Region, die die CUE-Domäne enthält, die eine Diversität in der Anwesenheit oder Abwesenheit der Domäne unter ihren Orthologen aufweist (Abb. 8e und ergänzende Abb. 8b). Das Cue2-Protein, SppC-Ortholog in Keimhefe, spielt eine Rolle bei der Ubiquitin-Bindung49. SppJ, das die DnaJ-Domäne enthält, weist eine orthologe Beziehung zur aufkeimenden Hefe Sis1 auf (ergänzende Abbildung 8e), die am Abbau zytosolischer fehlgefalteter Proteine ​​beteiligt ist . Die Beteiligung von Ubiquitinierung und fehlgefalteten Proteinreaktionen an der Septumporenregulation muss jedoch noch untersucht werden. Im Gegensatz dazu besitzt SppB in Ascomyceten-Hefen keine Orthologen (Abb. 7). Die Transglutaminasedomäne von SppB ist für ihre vernetzenden Eigenschaften bekannt, die bei der Wundheilung und Blutgerinnung bei Säugetieren nach Verletzungen eine Rolle spielen46. Diese Funktion ähnelt der wundbedingten Verstopfung der Pilzseptumpore.

Im Pilzreich soll sich die Hyphenmorphologie in den frühen divergierenden Pilzstämmen Blastocladiomycota, Chytridiomycota und Zoopagomycota entwickelt haben20. Die Septumpore und ihre Regulierung scheinen in den Unterstämmen Pezizomycotina und Agaricomycotina1 unabhängig voneinander entstanden zu sein. Daher waren während des evolutionären Übergangs von aseptierten Vorfahren viele genevolutionäre Ereignisse erforderlich, um die Organisation und Regulierung der Septumporen zu modulieren. Unsere orthologen Gruppen- und phylogenetischen Analysen (Abb. 7 und ergänzende Abb. 9) zeigten, dass zehn SPP-Gene spezifisch in Pezizomycotina vorhanden sind. In ähnlicher Weise wurde über eine spezifische Existenz innerhalb von Pezizomycotina für die körperbezogenen Woronin-Gene für Hex1, seinen Sortierrezeptor WSC, den Woronin-Körperbinder Leashin und mehrere SPA-Proteine ​​berichtet21. Es wurde vermutet, dass solche linienspezifischen Gene entweder aus ursprünglich nicht-genischen Regionen oder durch übermäßige Divergenz nach einer genomischen Neuordnung wie Rekombination, Retrotransposition und horizontalem Gentransfer entstanden sind60,61. Die Pezizomycotina-spezifische Existenz der zehn SPP- (Abb. 7 und ergänzende Abb. 9) und körperbezogenen Woronin-Gene 21 lässt darauf schließen, dass sie bei einem gemeinsamen Vorfahren von Pezizomycotina entstanden sind und anschließend durch vertikalen Transfer zur Unterstützung der septalporenbezogenen Funktionen erworben wurden. Dieses Phänomen ähnelt möglicherweise dem Phänomen, das mehreren linienspezifischen Genen zugrunde liegt, die in Hefen und Würmern vorhanden sind und funktionell mit der Chromosomensegregation verbunden sind62.

Unsere Ergebnisse belegen die Wirksamkeit der auf Bioinformatik basierenden Selektion zur Identifizierung vieler neuartiger Proteine, die an der Verstopfung der Poren des Pilzseptums bei Hyphenverletzungen beteiligt sind. Während der Entwicklung der Septumstruktur war die miteinander verbundene Zellorganisation möglicherweise anfällig für Umweltbedrohungen und physiologische Belastungen wie mechanische Verletzungen10, ununterbrochene Ausbreitung von Mykoviren63 und durch Allorekognition vermittelte Heterokaryon-Inkompatibilität64. Solche ungünstigen Bedingungen könnten einen Selektionsdruck zur Anpassung ausüben, entweder durch die Kooptation bereits vorhandener Gene oder durch den Erwerb neuer Gene zur Unterstützung der Septumporenregulation.

Ganze Proteome von sieben Pilzarten wurden aus der Genomdatenbank FungiDB (https://www.fungidb.org) abgerufen. Wir haben 12090 A. oryzae-Proteine ​​verwendet und jedes mit BLASTp abgefragt. Als Kriterium für den genomischen Vergleich wurde das Vorhandensein oder Fehlen der Septumpore als spezialisierte morphologische Struktur festgelegt. Wir suchten nach konservierten Genen in den septalporentragenden Ascomyceten A. oryzae, A. fumigatus und A. nidulans mit e-Werten kleiner oder gleich 1e-100; Anschließend suchten wir nach Genen, die in den Ascomyceten-Hefen S. cerevisiae, S. pombe und C. albicans fehlten oder divergierten, mit e-Werten größer oder gleich 1e-30. Dieser Prozess ergab 2130 mögliche Septumporenproteine ​​in A. oryzae.

Wir wählten vorzugsweise nicht charakterisierte Proteine ​​aus, definiert als solche, denen die biologischen Daten für GO-Begriffe in Bezug auf molekulare Funktionen, zelluläre Komponenten und biologische Prozesse fehlen. Insgesamt wurden 5878, 7868 und 5664 Gene für molekulare Funktionen, zelluläre Komponenten bzw. biologische Prozesse identifiziert. Insgesamt 3498 Gene, denen biologische Daten für alle drei GO-Begriffe fehlten, wurden schließlich als nicht charakterisierte Gene bestimmt. Anschließend haben wir innerhalb dieser nicht charakterisierten Untergruppe nach den oben genannten 2130 Kandidatenproteinen gesucht und 776 Gene für das Lokalisierungsscreening in die engere Wahl gezogen.

Die in dieser Studie verwendeten Stämme sind in den Zusatzdaten 3 aufgeführt. A. oryzae wurde wie zuvor beschrieben transformiert65. Als Elternstamm wurde der A. oryzae-Stamm NSPlD1 (niaD− sC− ΔpyrG ΔligD)10 verwendet. Unter Verwendung des pyrG-Selektionsmarkers wurden Transformanten unter Verwendung von M + Met-Medium [0,2 % NH4Cl, 0,1 % (NH4)2SO4, 0,05 % KCl, 0,05 % NaCl, 0,1 % KH2PO4, 0,05 % MgSO4 · 7H2O, 0,002 % FeSO4 · 7H2O, selektiert. 0,15 % Methionin und 2 % Glucose; pH-Wert 5,5]. Transformanten mit den selektierbaren Markern niaD und sC wurden unter Verwendung von CD-Medium (0,3 % NaNO3, 0,2 % KCl, 0,1 % KH2PO4, 0,05 % MgSO4 · 7H2O, 0,002 % FeSO4 · 7H2O und 2 % Glucose; pH 5,5) und CD + Met selektiert Medium ergänzt mit jeweils 0,0015 % Methionin. A. oryzae-Stämme wurden in Kartoffeldextrose (PD)-Medium (Nissui, Tokio, Japan) bei 30 ° C gehalten. Zur Transformation wurden die Stämme in DPY-Flüssigmedium (0,5 % Hefeextrakt, 1 % Hippolypepton, 2 % Dextrin, 0,5 % KH2PO4, 0,05 % MgSO4·7H2O, pH 5,5) inokuliert und über Nacht wachsen gelassen. Für die Mikroskopie wurden Konidien auf Glasbodenschalen geimpft, die 100 μl CD-Flüssigmedium, ergänzt mit 1 % Casaminosäuren, enthielten. Für Hyphenverletzungen wurde Agarmedium anstelle von Flüssigmedium verwendet. Zur vollständigen Induktion und Unterdrückung des AmyB-Promotors wurden dem CD-Medium jeweils 2 % Dextrin und 2 % Glycerin als Kohlenstoffquellen zugesetzt.

Nukleinsäuresequenzen für die 776 in Frage kommenden Septumporenproteine ​​wurden aus der Aspergillus-Genomdatenbank AspGD abgerufen (derzeit geschlossen, der Datensatz ist jedoch in der FungiDB-Datenbank verfügbar; https://fungidb.org/fungidb/app). Der für jedes Protein kodierende offene Leserahmen wurde aus genomischer RIB40-DNA mit PrimeSTAR® HS-DNA-Polymerase (TaKaRa Bio, Otsu, Japan) für eine High-Fidelity-PCR unter Verwendung der in den Ergänzungsdaten 6 aufgeführten Primer amplifiziert. Die amplifizierten Fragmente wurden dann mit fusioniert Kleinlinearisiertes pUt-C-EGFP10 mit dem In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech Laboratories, Mountain View, CA, USA). Mit dem egfp-Gen fusionierte Gensequenzen wurden hintereinander zwischen den Linkersequenzen positioniert. Rekombinante Plasmide, die für die Expression von EGFP-fusionierten Proteinen verwendet werden, wurden mit NotI verdaut und durch homologe Rekombination in den niaD-Locus des Wildtyp-Stamms NSlD110 eingefügt. Die Transformanten wurden basierend auf der Nitratassimilation ausgewählt. Für das Lokalisierungsscreening generierte EGFP-Fusions-exprimierende Stämme sind in den Zusatzdaten 3 aufgeführt.

Die zur Generierung der Deletionsstämme verwendeten Primer sind in den Zusatzdaten 6 aufgeführt. Einzelne Gene mit dem pyrG-Marker wurden durch Amplifikation der 1,5-kbp-Regionen stromaufwärts und stromabwärts der Gene unter Verwendung der Primersätze gene-upstream1_F/gene-upstream2_R und gene-downstream1_F ersetzt /gene-downstream2_R bzw. Der pyrG-Marker wurde aus genomischer RIB40-DNA unter Verwendung der Primer PyrG_F und PyrG_R amplifiziert. Die drei amplifizierten DNA-Fragmente (Upstream- und Downstream-Regionen der Zielgene und pyrG) und der linearisierte pUC19-Vektor wurden mit dem In-Fusion HD Cloning Kit fusioniert. Deletionskonstrukte wurden unter Verwendung des Primersatzes gene-upstream1_F/gene-downstream2_R aus dem resultierenden Plasmid als Matrize weiter amplifiziert und dann durch homologe Rekombination in den nativen Locus des A. oryzae-Stammes NSPlD110 eingeführt. Transformanten wurden mittels Uridin/Uracil-Prototrophie ausgewählt.

Deletionen von sppG, sppF und sppE mit dem sC-Marker wurden durch Amplifikation von 1,5 kbp großen Upstream- und Downstream-Regionen unter Verwendung der Primersätze gene_upstream1_F/gene-upstream2 (sC)_R bzw. gene-downstream1(sC)_F/gene-downstream2_R durchgeführt . Der sC-Marker wurde aus genomischer RIB40-DNA unter Verwendung der Primer sC_F und sC_R amplifiziert. Die drei Fragmente und der linearisierte pUC19-Vektor wurden fusioniert. PCR-amplifizierte Deletionskonstrukte von sppG, sppF und sppE wurden in die nativen Loci von ΔsppA/ΔsppP/ΔsppI/ΔsppT/ΔsppW/ΔsppL/ΔsppS/ΔsppJ/ΔsppQ, ΔsppM/ΔsppH/ΔsppO/ΔsppU/ΔsppR und ΔsppB/ eingeführt. ΔsppC/ΔsppD/ΔsppK/ΔsppN/ΔsppV.

Um die Zell-zu-Zell-Konnektivität über die Septumpore unter Kältestress zu analysieren (Abb. 5), wurde Dendra2, ein photokonvertierbares Fluoreszenzprotein von grün nach rot, verwendet10. Das Dendra2-exprimierende Plasmid pUt-NA-dendra210 wurde mit NotI amplifiziert und verdaut. Mit Ethanol präzipitierte DNA wurde durch homologe Rekombination in den niaD-Locus von Deletionsstämmen eingefügt, denen 62 septumlokalisierende Proteine ​​fehlten.

Um die Bedeutung der ungeordneten Region zu bestimmen, wurden Fragmente verwendet, die für die Reste 1–264 und 265–697 von SppB kodieren; 1–145 und 146–390 von SppD; 1–265 und 265–1234 von SppN; 1–92, 93–509, 1–192 und 193–470 von SppI; 1–99 und 100–962 von SppL; und 1–167 und 168–465 von SppW wurden amplifiziert. Für verkürzte Varianten, denen die N-terminale Region fehlt, wurde ein Startcodon hinzugefügt. Das einzelne Fragment wurde dann mit SmaI-linearisiertem pUt-C-EGFP fusioniert. Rekombinante Plasmide wurden mit NotI verdaut und durch homologe Rekombination in den niaD-Locus der entsprechenden Deletionshintergründe eingefügt.

Die zum Verkürzen von SppA und SppC verwendeten Primer sind in den Zusatzdaten 6 aufgeführt. Die amplifizierten verkürzten Fragmente wurden mit SmaI-verdautem pUt-C-EGFP fusioniert und anschließend wurde eine NotI-verdaute Expressionskassette in den niaD-Locus eingefügt. Um chimäre Proteine ​​von SppA zu erzeugen (Abb. 7), wurde eine DNA, die den N-Terminus (Reste 1–127) kodiert, aus genomischer RIB40-DNA und jene für die C-Termini von A. nidulans (Reste 126–810) amplifiziert. N. crassa (Reste 127–863) und S. pombe (Reste 135–810) wurden unter Verwendung der genomischen DNA der entsprechenden Stämme FGSC_A26, OR74A bzw. 972 h amplifiziert. Die Fragmente wurden mit SmaI-verdautem pUt-C-EGFP10 unter Verwendung des In-Fusion HD Cloning Kit fusioniert. Die konstruierten Plasmide wurden mit NotI verdaut und durch homologe Rekombination in den niaD-Locus von ΔsppA eingefügt.

SppC wurde sowohl am C- als auch am N-Terminus verkürzt. DNA-Fragmente, die die N-terminalen Reste 1–142 und 1–185 kodieren, wurden aus genomischer RIB40-DNA amplifiziert. Sie wurden mit SmaI-verdautem pUt-C-EGFP fusioniert. Um N-terminale Regionen, die die CUE-Domäne enthalten, zu kürzen, wurde ein DNA-Fragment, das für die Reste 143–556 kodiert, durch Hinzufügen eines ATG-Startcodons amplifiziert. Das Fragment und SmaI-verdautes pUt-C-EGFP wurden unter Verwendung des In-Fusion HD Cloning Kit fusioniert. Die konstruierten Plasmide wurden mit NotI verdaut und zum Einfügen von Expressionskassetten in den niaD-Locus von ΔsppC durch homologe Rekombination verwendet.

Apikale Septen lebender Hyphen, die EGFP-markierte Proteine ​​exprimieren, wurden unter Verwendung eines IX71-Umkehrmikroskops (Olympus, Tokio, Japan) beobachtet, das mit 100-fachen Neofluar-Objektiven (1,40 numerische Apertur) ausgestattet war; 488-nm- (Furukawa Electric, Tokio, Japan) und 561-nm-Halbleiterlaser (Melles Griot, Rochester, NY, USA); GFP-Filter (Nippon Roper, Tokio, Japan); ein konfokales Scansystem CSU22 (Yokogawa Electronics, Tokio, Japan); und eine gekühlte digitale CCD-Kamera von Andor iXon (Andor Technology PLC, Belfast, UK). Die Bilder wurden mit der Software Andor iQ 1.9 (Andor Technology PLC) analysiert.

Hyphenspitzen wurden durch Überfluten der Kolonien mit 1 ml Wasser nach dem Wachstum auf einer dünnen Schicht DPY-Agarmedium in einer Glasbodenschale bei 30 °C für 18 Stunden gesprengt. Nach der Überschwemmung wurde die Kolonie vor der Beobachtung zwei Minuten lang belassen. Dreißig zufällig ausgewählte Hyphen mit geplatzten Spitzen wurden mittels Differential-Interferenz-Kontrastmikroskopie beobachtet.

Um den Dendra2-Transfer zu analysieren, wurden Hyphen 17 Stunden lang bei 30 °C auf einer dünnen Schicht CD-Medium (2 % Dextrin als Kohlenstoffquelle), ergänzt mit 1 % Casaminosäuren, gezüchtet. Die Kultur wurde unter normalen oder Kältestressbedingungen (4 °C, 30 Minuten) weiter inkubiert. Vor der Beobachtung wurden die Hyphen mit einer UV-Quecksilberlampe beleuchtet, die mindestens 20 μm vom ausgewählten apikalen Septum entfernt positioniert war, um eine Beleuchtung der angrenzenden Zelle zu vermeiden, wie zuvor beschrieben10. Der Dendra2-Transfer über die Septumpore wurde nach Photokonvertierung mit 553-nm-Anregung beobachtet10.

Ungeordnete Regionen von SPP-Proteinen wurden mit IUPred2A31 annotiert. Für die Analyse der Aminosäurezusammensetzung wurden die Sequenzen der N. crassa SPA-Proteine ​​aus der FungiDB-Genomdatenbank abgerufen. Als ungeordnete Proteine/Regionen wurden von IUPred2A definierte ungeordnete Regionen von SPP- und SPA-Proteinen, ungeordnete Proteine ​​von Serin/Arginin-reichen (SR) Spleißfaktoren66 und Phenylalanin/Glycin-Repeats (FG)-Nukleoporinen67 sowie ungeordnete Proteine/Regionen aus der DisProt-Datenbank68 verwendet wurden benutzt. Die geordneten Proteine/Regionen wurden dem O_PDB_S25-Datensatz69 entnommen. Die Aminosäurezusammensetzungen verschiedener ungeordneter Proteine/Regionen wurden für jede Aminosäure gemäß der zuvor entwickelten Methode verglichen17,70. Die Bruchdifferenz wurde als (PX − Porder)/Porder berechnet, wobei PX den Prozentsatz einer bestimmten Aminosäure im Satz ungeordneter Proteine/Regionen der Abfrage darstellt und Porder den entsprechenden Prozentsatz geordneter Proteine/Regionen im Datensatz O_PDB_S25 bezeichnet.

Dreiundzwanzig SPP-Proteine ​​wurden mit Simple Modular Architecture Research Tools (SMART: http://smart.embl-heide lberg.de/)71 analysiert, um vorhergesagte Domänen zu erkennen. Um die Erhaltung der Primärsequenz zu analysieren, wurden mehrere Sequenz-Alignments mit ClustalW72 durchgeführt und die Ausgaben wurden mit BoxShade-Server Version 3.21 präsentiert.

Für die orthologe Gruppenanalyse haben wir Pilzproteomdaten erhalten, die vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) und vom Pilzportal MycoCosm des Joint Genome Institute (JGI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) verfügbar sind ://mycocosm.jgi.doe.gov/mycocosm/home) Datenbanken. Insgesamt wurden 81 Pilzarten ausgewählt, um alle wichtigen Pilzklassen aus den Unterstämmen Ascomycota (Taphrinomycotina, Saccharomycotina und Pezizomycotina) und Basidiomycota (Agaricomycotina, Pucciniomycotina und Ustilaginomycotina) sowie repräsentative Stämme von Mucoromycota, Zoopagomycota und Chytridiomycota abzudecken , Blastocladiomycota und Rozellomycota (Ergänzende Daten 5d). Orthologe Gruppen wurden mit OrthoFinder 2.3.1436 mit den Standardparametern analysiert.

Für die Analyse der Substitutionsrate folgten wir einer zuvor beschriebenen Methode21. Aus jeder Pilzart wurde ein repräsentatives Protein ausgewählt, das phylogenetisch den orthologen Pezizomycotina-Proteinen nahe kommt (Supplementary Data 5b). Für einzelne Proteine ​​wurden unter Verwendung von ClustalW72 mehrere Sequenz-Alignments mit einheitlichen Lückenstrafen erstellt, einschließlich Lückenöffnungsstrafen und Lückenerweiterungsstrafen. Mit PhyML wurden für jedes Protein Maximum-Likelihood-Bäume generiert. Phylogenetische Bäume wurden bestätigt, indem sie mit einem anderen Tool, dem Molecular Evolutionary Genetics Tool, MEGA 773, konstruiert wurden. Die Substitutionsrate wurde für eine bestimmte Art x im entsprechenden Baum berechnet und der evolutionäre Abstand zwischen Proteinsequenzen und Pezizomycotina-Vorfahrensequenzen von A . Oryzae-SPP-Proteine ​​wurden durch den Score \(s\left(x\right)=d\left(x\right)-\frac{{\sum }_{y\in {Pezizomycotina}}d(y)} geschätzt. {P}\) (Einheit: Substitutionen/Stelle), wobei d(x) die Verzweigungslänge von Art x bis zur Pezizomycotina-Wurzel angibt. P stellt die Anzahl der Arten y in Pezizomycotina dar, die in der phylogenetischen Analyse verwendet werden, und daher stellt \(\frac{{\sum }_{y\in {Pezizomycotina}}d(y)}{P}\) die durchschnittliche Zweiglänge von dar Jede Art y in Pezizomycotina zur Pezizomycotina-Wurzel.

Um orthologe Beziehungen weiter aufzuklären, wurden phylogenetische Bäume unter Verwendung aller Proteine ​​erstellt, die in dieselbe orthologe Gruppe eingeordnet wurden. Mit MEGA 773 wurden mehrere Sequenz-Alignments durchgeführt und unbewurzelte phylogenetische Bäume für analysierte Proteine ​​erstellt.

Die Stämme wurden 18 Stunden lang auf DPY-Medium kultiviert. Die Pilzmyzelien wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend mit einem Mehrperlenschocker gemahlen. Nach der Extraktion wurden die Zelllysate mit einem Puffer inkubiert, der das Detergens NP-40 enthielt [50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM/ml PMSF, 1× Protease-Inhibitor-Cocktail (Sigma, St. Louis, MO, USA: P8215), 1 % NP-40] zur Solubilisierung der Membranproteine. Mit dem Puffer solubilisierter Myzelextrakt wurde 20 Minuten lang in Eis inkubiert. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 1000 × g wurde der Überstand gesammelt. Zelllysate wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Die Proteine ​​wurden unter Verwendung eines halbtrockenen Blotting-Systems (Nihon Eido, Tokio, Japan) auf Immobilon-P-Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen (Millipore Sigma, Burlington, MA, USA) übertragen. Zum Nachweis von EGFP werden der monoklonale Antikörper Living Colors® AV (Anti-GFP) (Verdünnung 1:2000, Kat.-Nr. 632380, Clontech) und der mit Peroxidase markierte Anti-Maus-IgG (H + L)-Antikörper (Verdünnung 1:2000, Kat.-Nr. PI) verwendet -2000, Vector Laboratories, Newark, CA, USA) wurden als primäre bzw. sekundäre Antikörper verwendet. Chemilumineszenz wurde mit einem Western Lightning-ECL-System (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) und einem LAS-4000-Bildanalysator (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) nachgewiesen.

Als Mittelwerte werden die Ergebnisse von mindestens drei unabhängigen Experimenten dargestellt. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar, wie in den Legenden der Abbildungen angegeben. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des zweiseitigen Student-t-Tests in Microsoft Excel getestet. Die Signifikanz wird als *P < 0,05 oder **P < 0,01 angegeben.

Wenn repräsentative Bilder gezeigt werden (Abb. 2b; 3a–c; 4a, c–f; 5a; 6a, b; 8b, c, f; und ergänzende Abb. 1, 2, 3a, b, 4a–e, 5a, b, 10a, b) wurden drei unabhängige Hyphen beobachtet und ein repräsentatives Bild wird gezeigt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Daten, die die Ergebnisse der vorliegenden Studie stützen, sind in diesem Dokument, den Zusatzinformationen und den Quelldaten verfügbar. Gensequenzen von A. oryzae finden Sie in FungiDB (https://fungidb.org/fungidb/app) und die Sequenzen von Pilzorthologen finden Sie in NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov). /). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Diese Studie wurde von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) mit der KAKENHI-Zuschussnummer 21H02098 (JM), dem Zuschuss für wissenschaftliche Forschung (B), und 21F21099 (JM), dem Zuschuss für, unterstützt JSPS-Stipendiaten. SN wurde vom Top Priority Research Program der Toyo University unterstützt. Wir danken Dr. Kensuke Seto (Fakultät für Umwelt- und Informationswissenschaften, Yokohama National University, Kanagawa, Japan) für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir möchten Editage (www.editage.com) für die Bearbeitung in englischer Sprache danken.

Abteilung für Biotechnologie, Universität Tokio, Tokio, Japan

MD. Abdulla Al Mamun und Jun-ichi Maruyama

Forschungszentrum für landwirtschaftliche Informationstechnologie, Nationale Organisation für Landwirtschaft und Lebensmittelforschung (NARO), Tsukuba, Ibaraki, Japan

Wei Cao

Abteilung für Informationsnetzwerke für Innovation und Design, Fakultät für Informationsnetzwerke für Innovation und Design, Toyo-Universität, Tokio, Japan

Shugo Nakamura

Kollaboratives Forschungsinstitut für innovative Mikrobiologie, Universität Tokio, Tokio, Japan

Jun-ichi Maruyama

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MAAM und JM haben die Studie konzipiert und gestaltet. MAAM führte Experimente durch und MAAM und JM interpretierten die Ergebnisse. SN und WC führten die groß angelegte BLAST-Suche durch und interpretierten die Daten. JM führte orthologe Gruppen- und phylogenetische Analysen durch und alle Autoren interpretierten die Daten. MAAM und JM haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Jun-ichi Maruyama.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt László Nagy und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mamun, MAA, Cao, W., Nakamura, S. et al. Groß angelegte Identifizierung von Genen, die an der Verstopfung der Septumporen bei mehrzelligen Pilzen beteiligt sind. Nat Commun 14, 1418 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36925-y

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Eingegangen: 20. Januar 2022

Angenommen: 23. Februar 2023

Veröffentlicht: 17. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36925-y

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