Myonectin schützt vor Funktionsstörungen der Skelettmuskulatur bei männlichen Mäusen durch Aktivierung des AMPK/PGC1α-Signalwegs

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4675 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Erhaltung und Wiederherstellung der Skelettmuskelmasse und -funktion ist für ein gesundes Altern von entscheidender Bedeutung. Wir haben herausgefunden, dass Myonectin als kardioprotektives Myokin wirkt. Hier untersuchen wir die Wirkung von Myonectin auf die Atrophie der Skelettmuskulatur in verschiedenen männlichen Mausmodellen für Muskeldysfunktion. Eine Störung von Myonektin verschlimmert die Skelettmuskelatrophie in altersbedingten, durch Ischias-Denervierung induzierten oder durch Dexamethason (DEX) induzierten Muskelatrophiemodellen. Ein Myonektinmangel trägt auch zu einer verschlimmerten mitochondrialen Dysfunktion bei und verringert die Expression mitochondrialer Biogenese-assoziierter Gene, einschließlich PGC1α, im denervierten Muskel. Eine Myonectin-Supplementierung mildert die durch Denervierung verursachte Muskelatrophie durch Aktivierung von AMPK. Myonectin kehrt durch die AMPK/PGC1α-Signalübertragung auch die DEX-induzierte Atrophie kultivierter Myotuben um. Darüber hinaus unterdrückt die Myonectin-Behandlung die Muskelatrophie im SAMP-8-Mausmodell für beschleunigtes Altern (Seneszenz-beschleunigtes Mausmodell) oder im MDX-Mausmodell für Duchenne-Muskeldystrophie. Diese Daten deuten darauf hin, dass Myonektin Funktionsstörungen der Skelettmuskulatur durch AMPK/PGC1α-abhängige Mechanismen lindern kann, was darauf hindeutet, dass Myonektin ein therapeutisches Ziel bei Muskelatrophie darstellen könnte.

Die Diskrepanz zwischen der durchschnittlichen Lebenserwartung und der gesunden Lebenserwartung ist in älteren Gesellschaften weltweit ein ernstes soziales Problem. Der altersbedingte Verlust von Muskelmasse und -funktion, auch Sarkopenie genannt, ist einer der entscheidenden Faktoren für körperliche Behinderung und führt zu unerwünschten Folgen wie schlechter Lebensqualität und Tod1. Krafttraining führt zu einer Verbesserung der Muskelmasse und -funktion und wirkt sich positiv auf die Sarkopenie aus. Allerdings machen Behinderungen, die durch altersbedingte Komplikationen wie Schlaganfall, Knochenbruch und krebsbedingte Kachexie verursacht werden, ein körperliches Training bei älteren Patienten unpraktisch oder ineffizient. Daher könnte die Entwicklung therapeutischer Ansätze zur Erhaltung und Wiederherstellung der Skelettmuskelmasse und -funktion für ein gesundes Altern unverzichtbar sein.

Myonectin, auch bekannt als C1q/TNF-verwandtes Protein 15/Erythroferron, fungiert als ein vom Muskel abgeleiteter sezernierter Faktor, auch Myokin genannt, der reichlich im Skelettmuskelgewebe exprimiert wird2,3. Es wurde berichtet, dass Myonectin den Fettsäurestoffwechsel, den Eisenstoffwechsel, die Differenzierung von Osteoblasten und Osteoklasten sowie die Adipogenese moduliert4,5,6,7,8. Kürzlich haben wir berichtet, dass Myonectin ein durch körperliche Betätigung hervorgerufenes Myokin ist, das das Herz vor Ischämie-Reperfusionsschäden schützt9. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Myonektin endokrine Auswirkungen auf nahegelegene oder entfernte Organe hat, um die Homöostase des gesamten Körpers aufrechtzuerhalten. Der Einfluss von Myonectin auf die Funktion und Erkrankung der Skelettmuskulatur auf autokrine Weise ist jedoch nicht geklärt. Hier untersuchten wir, ob Myonectin die Skelettmuskelfunktion in verschiedenen Mausmodellen für Muskeldysfunktionen, einschließlich altersbedingter Sarkopenie, moduliert.

Wir untersuchten, ob die Expression von Muskelmyonektin durch den Alterungsprozess moduliert wird. Die mRNA- und Proteinspiegel von Myonectin (Fam132b) im Soleus- und Gastrocnemius-Muskelgewebe waren bei 80 Wochen alten (alten) WT-Mäusen signifikant niedriger als bei 20 Wochen alten (jungen) WT-Mäusen (Abb. 1a und ergänzende Abb. 1). Um zu untersuchen, ob Myonectin zur Skelettmuskelmasse und -funktion bei alten Mäusen beiträgt, wurden Muskelgewicht und -stärke bei jungen und alten Myonectin-Knockout-Mäusen (KO) bewertet. Das Gewicht des Gastrocnemius- und Soleus-Muskelgewebes geteilt durch das Körpergewicht war bei gealterten Myonectin-KO-Mäusen signifikant niedriger als bei gealterten WT-Mäusen, wohingegen es keine signifikanten Unterschiede im Muskelgewicht zwischen jungen WT- und jungen Myonectin-KO-Mäusen gab (Abb. 1b). . Gealterte Myonectin-KO-Mäuse zeigten im Vergleich zu gealterten WT-Mäusen ein erhöhtes Körpergewicht, während sich das Körpergewicht zwischen jungen WT- und jungen Myonectin-KO-Mäusen nicht unterschied (ergänzende Abbildung 2a). Das Gewicht des Gastrocnemius-Muskels war bei gealterten Myonectin-KO-Mäusen signifikant geringer als bei gealterten WT-Mäusen (ergänzende Abbildung 2a). Das Gewicht des Soleus-Muskels schien bei gealterten Myonectin-KO-Mäusen geringer zu sein als bei gealterten WT-Mäusen, dies war jedoch statistisch nicht signifikant. Es gab keine signifikanten Unterschiede im Gewicht des Gastrocnemius-Muskels und des Soleus-Muskels zwischen jungen WT- und jungen Myonectin-KO-Mäusen.

a Die mRNA-Spiegel von Myonectin (Fam132b) in Soleus- (N = 9 in jeder Gruppe) und Gastrocnemius-Muskeln (N = 10 in jeder Gruppe) von 20 Wochen alten jungen und 80 Wochen alten WT-Mäusen. b–e Muskelmasse und -stärke wurden bei 20 Wochen alten jungen WT-Mäusen, 20 Wochen alten jungen Myonectin-KO-Mäusen, 80 Wochen alten WT-Mäusen und 80 Wochen alten Myonectin-KO-Mäusen beurteilt. b Das Verhältnis des Gewichts des Gastrocnemius- oder Soleus-Muskels zum Körpergewicht wird angezeigt. N = 6 in jeder Gruppe. c Die linken Felder zeigen repräsentative Querschnittsbilder des Gastrocnemius-Muskels. Maßstabsbalken zeigen 100 μm. Die rechten Felder zeigen die Quantifizierung der mittleren Querschnittsfläche (CSA) und der CSA-Verteilung. N = 6 in jeder Gruppe. d Die maximale Griffstärke in 4 Gliedmaßen oder vor 2 Gliedmaßen, normalisiert durch das Körpergewicht, wird angezeigt. N = 6 in jeder Gruppe. e Durchschnittliche Anzahl der Umdrehungen pro Tag, gemessen durch freiwilligen Radlauftest. N = 6 in jeder Gruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test für a. Es wurde eine einfaktorielle ANOVA mit einer Post-hoc-Analyse für b–e durchgeführt. Gastroc. Gastrocnemius-Muskel, BW-Körpergewicht.

Konsistent war die mittlere Querschnittsfläche (CSA) des Gastrocnemius-Muskelgewebes bei gealterten Myonectin-KO-Mäusen signifikant kleiner als bei alten WT-Mäusen, wohingegen es keine Unterschiede in der CSA des Gastrocnemius-Muskelgewebes zwischen jungen WT- und jungen Myonectin-KO-Mäusen gab ( Abb. 1c). Konsistent zeigten gealterte Myonectin-KO-Mäuse im Vergleich zu gealterten WT-Mäusen eine geringere Größenverteilung des Gastrocnemius-Muskel-CSA (Abb. 1c). Darüber hinaus war der mittlere CSA der Typ-II-Muskelfasern im Gastrocnemius-Muskel bei gealterten Myonectin-KO-Mäusen signifikant kleiner als bei gealterten WT-Mäusen (ergänzende Abbildung 3a, b). Es gab keine Unterschiede im mittleren CSA der Typ-I-Muskelfasern im Gastrocnemius-Muskel zwischen gealterten WT- und gealterten Myonectin-KO-Mäusen (ergänzende Abbildung 3a, b). Gealterte Myonectin-KO-Mäuse zeigten im Vergleich zu gealterten WT-Mäusen eine erhöhte Häufigkeit kleinerer Typ-II-Faser-CSA, wohingegen sich die Verteilung der Typ-I-Faserquerschnittsfläche zwischen gealterten WT- und gealterten Myonectin-KO-Mäusen nicht unterschied (ergänzende Abbildung 3b). . Ältere WT-Mäuse wiesen im Vergleich zu jungen WT-Mäusen eine erhöhte Häufigkeit von Typ-I-Fasern im Gastrocnemius-Muskel auf, und gealterte Myonectin-KO-Mäuse zeigten im Vergleich zu gealterten WT-Mäusen eine verringerte Häufigkeit von Typ-I-Fasern (ergänzende Abbildung 3c).

Darüber hinaus zeigten gealterte Myonectin-KO-Mäuse im Vergleich zu gealterten WT-Mäusen eine signifikante Verringerung der maximalen Griffkraft in 4 Gliedmaßen und in den beiden vorderen Gliedmaßen, die durch das Körpergewicht normalisiert wurde (Abb. 1d). Bei gealterten Myonectin-KO-Mäusen kam es im Vergleich zu gealterten WT-Mäusen auch zu einer signifikanten Verringerung der nicht normalisierten maximalen Griffkraft in vier Gliedmaßen (ergänzende Abbildung 2b). Die nicht normalisierte maximale Griffkraft in den vorderen beiden Gliedmaßen schien bei gealterten Myonectin-KO-Mäusen niedriger zu sein als bei gealterten WT-Mäusen, dies war jedoch statistisch nicht signifikant. Die maximale Griffkraft in 4 Gliedmaßen und in den vorderen 2 Gliedmaßen, die durch das Muskelgewicht normalisiert wurde, unterschied sich nicht zwischen alten WT- und alten Myonectin-KO-Mäusen. Es gab keine signifikanten Unterschiede in der maximalen Griffkraft in 4 Gliedmaßen und in den vorderen 2 Gliedmaßen, die nicht normalisiert oder durch Körpergewicht oder Muskelgewicht normalisiert waren, zwischen jungen WT- und jungen Myonectin-KO-Mäusen. Im freiwilligen Radlauftest zeigten gealterte Myonectin-KO-Mäuse im Vergleich zu gealterten WT-Mäusen eine bemerkenswerte Verringerung der durchschnittlichen Anzahl von Umdrehungen (Abb. 1e). Somit könnte die Myonektinreduktion bei älteren Mäusen Muskelatrophie und -dysfunktion fördern.

Um die Rolle von Myonectin bei der Muskelatrophie weiter zu untersuchen, wurden Myonectin-KO- und WT-Mäuse einer durch Denervierung oder Dexamethason (DEX) induzierten Muskelatrophie ausgesetzt. Die Myonectin-Proteinspiegel im Gastrocnemius-Muskelgewebe waren bei denervierungsoperierten und DEX-behandelten WT-Mäusen im Vergleich zu Schein-WT-Mäusen signifikant verringert (ergänzende Abbildung 4a). 5 Tage nach der Denervierung des Ischiasnervs waren die durch das Körpergewicht normalisierten Gewichte der denervierten Gastrocnemius- und Soleus-Muskelgewebe bei Myonectin-KO-Mäusen signifikant niedriger als bei WT-Mäusen (Abb. 2a). Es gab keine signifikanten Unterschiede im Körpergewicht, im Gewicht des denervierten Gastrocnemius-Muskels und im Gewicht des denervierten Soleus-Muskels zwischen WT- und Myonectin-KO-Mäusen (ergänzende Abbildung 2c). Es gab keine signifikanten Unterschiede im Gewicht des nicht denervierten Gastrocnemius- und Soleus-Muskelgewebes, das durch das Körpergewicht zwischen WT- und Myonectin-KO-Mäusen nicht normalisiert oder normalisiert wurde (Abb. 2a und ergänzende Abb. 2c).

a, b WT- und Myonectin-KO-Mäuse im Alter von 8–10 Wochen wurden einer durch Ischias-Denervierung induzierten Muskelatrophie-Operation unterzogen. Fünf Tage nach der Denervierung des Ischiasnervs wurden die denervierten und nicht denervierten (kontralateralen) Muskeln für Analysen verwendet. Dargestellt ist ein Gastrocnemius- (n = 11 Mäuse pro Gruppe) oder Soleus-Muskelgewicht/Körpergewichtsverhältnis (N = 6 bei nicht denervierten WT-, nicht denervierten KO- und denervierten WT-Mäusen, N = 5 bei denervierten KO-Mäusen). b Die linken Felder zeigen repräsentative Querschnittsbilder der Gastrocnemius-Muskelfasern. Maßstabsbalken zeigen 100 μm. Die rechten Felder zeigen quantitative Analysen der mittleren Querschnittsfläche (CSA) und der CSA-Verteilung des Gastrocnemius-Muskels. N = 5 in jeder Gruppe. c, d 14 Tage nach der kontinuierlichen Verabreichung von Dexamethason (DEX) oder Vehikel (Sham) wurden WT- und Myonectin-KO-Mäuse zur Analyse getötet. c Das Verhältnis des Gewichts des Gastrocnemius- oder Soleus-Muskels zum Körpergewicht wird angezeigt. N = 5 in jeder Gruppe. d Die linken Felder zeigen repräsentative Querschnittsbilder der Gastrocnemius-Muskelfasern. Maßstabsbalken zeigen 100 μm. Die rechten Felder zeigen quantitative Analysen des mittleren CSA und der CSA-Verteilung des Gastrocnemius-Muskels. N = 5 in jeder Gruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Es wurde eine einfaktorielle ANOVA mit einer Post-hoc-Analyse für a–d durchgeführt. Gastroc. Gastrocnemius-Muskel, BW-Körpergewicht, DEX Dexamethason.

Der mittlere CSA des denervierten Gastrocnemius- und Soleus-Muskelgewebes war bei Myonectin-KO-Mäusen signifikant kleiner als bei WT-Mäusen, wohingegen es zwischen WT- und Myonectin-KO-Mäusen keine Unterschiede im CSA des nicht denervierten Gastrocnemius- und Soleus-Muskels gab (Abb. 2b und Ergänzung). Abb. 4b). Myonectin-KO-Mäuse hatten im Vergleich zu WT-Mäusen eine geringere Größenverteilung der CSA des denervierten Gastrocnemius- und Soleus-Muskels (Abb. 2b, ergänzende Abb. 4b).

Der mittlere CSA der Typ-II-Muskelfasern im denervierten Gastrocnemius- und Soleus-Muskel war bei Myonectin-KO-Mäusen signifikant kleiner als bei WT-Mäusen, wohingegen keine Unterschiede im mittleren CSA der Typ-I-Muskelfasern im denervierten Muskel zwischen WT- und Myonectin-KO-Mäusen beobachtet wurden ( Ergänzende Abbildungen 5a, b und 6a, b). Myonectin-KO-Mäuse zeigten im Vergleich zu WT-Mäusen eine erhöhte Häufigkeit kleinerer Typ-II-Faser-CSA des denervierten Gastrocnemius- und Soleus-Muskels, wohingegen sich die Verteilung von Typ-I-Faser-CSA im denervierten Muskel zwischen WT- und Myonectin-KO-Mäusen nicht unterschied (Ergänzende Abbildungen). 5b und 6b). Es gab keine Unterschiede in der Häufigkeit von Typ-I-Fasern im Gastrocnemius- und Soleus-Muskel nach Denervierung zwischen WT- und Myonectin-KO-Mäusen (ergänzende Abbildungen 5c und 6c). Bei WT- und Myonektin-KO-Mäusen wurde im nicht denervierten oder denervierten Gastrocnemius-Muskel eine geringe Fibrose beobachtet, und im Bereich der interstitiellen Fibrose zwischen WT- und Myonektin-KO-Mäusen wurden keine Unterschiede beobachtet (ergänzende Abbildung 7).

Darüber hinaus normalisierten sich 14 Tage nach der kontinuierlichen Verabreichung von DEX die Gewichte des Gastrocnemius- und Soleus-Muskelgewebes durch das Körpergewicht im Vergleich zu WT-Mäusen (Abb. 2c). Das Körpergewicht unterschied sich nicht zwischen DEX-behandelten WT- und Myonectin-KO-Mäusen (ergänzende Abbildung 2d). Das Gewicht des Gastrocnemius- und Soleus-Muskelgewebes schien bei DEX-behandelten Myonectin-KO-Mäusen geringer zu sein als bei DEX-behandelten WT-Mäusen, dies war jedoch statistisch nicht signifikant. Es gab keine signifikanten Unterschiede im Körpergewicht, im Gewicht des Gastrocnemius-Muskels und im Gewicht des Soleus-Muskels zwischen scheinbehandelten WT- und Myonectin-KO-Mäusen (ergänzende Abbildung 2d).

Der mittlere CSA des Gastrocnemius-Muskels war bei Myonectin-KO-Mäusen nach DEX-Behandlung im Vergleich zu WT-Mäusen signifikant verringert (Abb. 2d). Myonectin-KO-Mäuse hatten nach der DEX-Behandlung im Vergleich zu WT-Mäusen eine geringere Größenverteilung der CSA des Gastrocnemius-Muskels (Abb. 2d). Der mittlere CSA der Typ-II-Muskelfasern im Gastrocnemius-Muskel war bei DEX-behandelten Myonectin-KO-Mäusen signifikant kleiner als bei DEX-behandelten WT-Mäusen, wohingegen es keine Unterschiede im mittleren CSA der Typ-I-Muskelfasern zwischen DEX-behandelten WT-Mäusen und DEX gab -behandelte Myonectin-KO-Mäuse (Ergänzende Abb. 8a, b). Die erhöhte Häufigkeit kleinerer Typ-II-Faser-CSA des Gastrocnemius-Muskels wurde bei DEX-behandelten Myonectin-KO-Mäusen im Vergleich zu DEX-behandelten WT-Mäusen beobachtet, wohingegen sich die Verteilung von Typ-I-Faser-CSA im Gastrocnemius-Muskel zwischen DEX-behandelten WT-Mäusen nicht unterschied DEX-behandelte Myonectin-KO-Mäuse (ergänzende Abbildung 8b). Keine Unterschiede im prozentualen Anteil der Typ-I-Fasern im Gastrocnemius-Muskel nach DEX-Behandlung zwischen WT- und Myonectin-KO-Mäusen (ergänzende Abbildung 8c).

Die maximale Griffkraft in 4 Gliedmaßen und vor 2 Gliedmaßen, die nicht normalisiert oder durch das Körpergewicht normalisiert wurde, war bei DEX-behandelten Myonectin-KO-Mäusen im Vergleich zu DEX-behandelten WT-Mäusen signifikant verringert (ergänzende Abbildung 2e). Die maximale Griffkraft in vier Gliedmaßen, jedoch nicht in den beiden vorderen Gliedmaßen, die durch das Muskelgewicht normalisiert wurde, war bei DEX-behandelten Myonectin-KO-Mäusen im Vergleich zu DEX-behandelten WT-Mäusen signifikant verringert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Myonectin die Atrophie der Skelettmuskulatur als Reaktion auf mehrere pathologische Reize modulieren könnte.

Um den molekularen Mechanismus zu untersuchen, durch den Myonektinmangel die Muskelatrophie fördert, haben wir die mRNA-Expression im denervierten Gastrocnemius von WT- und Myonektin-KO-Mäusen mithilfe von RNA-Seq umfassend analysiert. Die Analyse der differentiellen Genexpression mit einem FDR-angepassten p-Wert <0,05 und einer absoluten log2-fachen Änderung >0,5 identifizierte 1.399 hochregulierte und 573 herunterregulierte Gene in Myonectin-KO-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen (Abb. 3a). Die Signalweganreicherungsanalyse der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ergab, dass Myonektin-abhängige Genveränderungen mit dem Signalweg bei Krebs, Proteoglykanen bei Krebs, der fokalen Adhäsion, dem Adipozytokin-Signalweg, dem AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK)-Signalweg und dem Apelin-Signalweg verbunden waren Weg (Abb. 3a). Unter diesen unterschiedlich regulierten Gensätzen ist bekannt, dass der AMPK-Signalweg die Funktion der Skelettmuskulatur reguliert. Da PGC1α ein entscheidendes Downstream-Ziel von AMPK ist, das Muskeldysfunktionen in Muskelatrophiemodellen verhindert10,11,12,13, werden die Expressionsniveaus von PGC1α im denervierten und nicht-denervierten Gastrocnemius-Muskel von WT- und Myonectin-KO-Mäusen in quantitativer Echtzeit bewertet PCR-Methoden. Die mRNA-Spiegel von Pgc1α in denervierten Gastrocnemius-Muskeln waren bei Myonectin-KO-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen signifikant verringert (Abb. 3b). Bemerkenswert ist, dass die Expressionsniveaus von Pgc1α4, die speziell mit Muskelhypertrophie zusammenhängen, bei Myonectin-KO-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen ebenfalls herunterreguliert waren (Abb. 3b). Ebenso waren die Proteinspiegel von PGC1α und PGC1α4 im denervierten Gastrocnemius-Muskel bei Myonectin-KO-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen verringert (Abb. 3c). Darüber hinaus waren die Phosphorylierungsniveaus von AMPK im denervierten Gastrocnemius-Muskel bei Myonectin-KO-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen verringert (Abb. 3c). Darüber hinaus waren die Proteinspiegel des insulinähnlichen Wachstumsfaktors (IGF1), der durch PGC1α414 hochreguliert wird, im denervierten Gastrocnemius-Muskel bei Myonectin-KO-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen verringert (Abb. 3c). Im Gegensatz dazu unterschieden sich die Expressionsniveaus von Ubiquitin-Ligase-verwandten Genen, einschließlich F-Box-Only-Protein (Fbxo) 32 und dreigliedrigem Motiv enthaltendem (Trim) 63, Myostatin (Mstn) und myogenen Genen, einschließlich Myod1 und Myog, in denervierten Muskeln nicht zwischen WT und Myonectin-KO-Mäuse (Abb. 3d). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein Myonektinmangel die Muskelatrophie aufgrund der Herunterregulierung der AMPK/PGC1α-Signalwege verschlimmern könnte.

a–d WT- und Myonectin-KO-Mäuse im Alter von 8–10 Wochen wurden einer durch Ischias-Denervierung induzierten Muskelatrophie-Operation unterzogen. Fünf Tage nach der Denervierung des Ischiasnervs wurden die denervierten und nicht denervierten (kontralateralen) Gastrocnemius-Muskeln für Analysen verwendet. a Veränderungen der Genexpression im denervierten Gastrocnemius-Muskel zwischen WT- und Myonectin-KO-Mäusen werden durch RNA-Sequenz ausgewertet. Das linke Feld zeigt MA-Diagramme unterschiedlich regulierter Gene zwischen Myonectin-KO- und WT-Mäusen. Die x-Achse stellt die mittleren normalisierten Zählungen dar und die y-Achse zeigt die log2-fache Änderung. Rote Diagramme zeigen signifikant regulierte Gene mit einem FDR-bereinigten p-Wert < 0,05 und einer absoluten log2-fachen Änderung > 0,5. Das rechte Feld zeigt die Anreicherungsanalyse des KEGG-Signalwegs für signifikant unterschiedlich regulierte Gene. N = 4 in jeder Gruppe. b Die mRNA-Spiegel von Pgc1α und Pgc1α4 werden durch quantitative PCR-Analyse bewertet. N = 6 bei nicht-denervierten und denervierten WT-Mäusen. N = 5 bei nicht-denervierten und denervierten KO-Mäusen. c Die linken Felder zeigen repräsentative Western-Blot-Analysen von pAMPK, AMPK, PGC1α, PGC1α4, IGF1 und Tubulin. Die rechten Felder zeigen quantitative Analysen der auf das Tubulinsignal normalisierten PGC1α-, PGC1α4-, pAMPK- und IGF1-Signale. N = 5 in jeder Gruppe. d Die mRNA-Spiegel von Ubiquitin-Ligase und myogenen Genen. N = 6 bei nicht-denervierten und denervierten WT-Mäusen. N = 5 bei nicht-denervierten und denervierten KO-Mäusen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Es wurde eine einfaktorielle ANOVA mit einer Post-hoc-Analyse für b–d durchgeführt.

Da PGC1α ein wichtiger Regulator der mitochondrialen Biogenese ist10, haben wir untersucht, ob ein Myonektinmangel zur mitochondrialen Dysfunktion als Reaktion auf Muskelatrophie beiträgt. Die Expressionsniveaus der mitochondrialen Biogenese-bezogenen Gene, einschließlich Tfam, Sirt1, Nrf1 und Nfe2l2, im denervierten Muskel waren bei Myonectin-KO-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen signifikant niedriger (Abb. 4a).

a–d WT- und Myonectin-KO-Mäuse im Alter von 8–10 Wochen wurden einer durch Ischias-Denervierung induzierten Muskelatrophie-Operation unterzogen. Fünf Tage nach der Denervierung des Ischiasnervs wurden die denervierten und nicht denervierten Gastrocnemius-Muskeln für Analysen verwendet. a Die mRNA-Spiegel von Genen, die mit der mitochondrialen Biogenese zusammenhängen, wurden mittels quantitativer Echtzeit-PCR-Methode bewertet. N = 6 bei nicht-denervierten und denervierten WT-Mäusen. N = 5 bei nicht-denervierten und denervierten KO-Mäusen. b Die oberen Felder zeigen repräsentative elektronenmikroskopische Aufnahmen der Gastrocnemius-Muskeln. Der Pfeil zeigt veränderte Mitochondrien. Veränderte Mitochondrien werden als Mitochondrien definiert, bei denen sich die äußere und innere Membran teilweise oder vollständig trennt und anschwillt. Die unteren Felder zeigen die Quantifizierung der intramyofibrillären Mitochondrienzahl und des veränderten Mitochondrienprozentsatzes. N = 5 in jeder Gruppe. Maßstabsbalken zeigen 1 μm in X15.000 und 400 nm in X50.000. c Die relative Citrat-Synthase-Aktivität in isolierten mitochondrialen Fraktionen aus denervierten Gastrocnemius-Muskeln wurde gemessen. N = 6 bei nicht-denervierten und denervierten WT-Mäusen. N = 5 bei nicht-denervierten und denervierten KO-Mäusen. d Das linke Feld zeigt repräsentative Western-Blot-Analysen von oxidativen Phosphorylierungskomplexen. Die rechten Felder zeigen quantitative Analysen der Komplex-I- und Komplex-II-Signale. N = 5 in jeder Gruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Es wurden eine einfaktorielle ANOVA (a, b) mit einer Post-hoc-Analyse und ein zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test (c, d) durchgeführt.

Wir haben auch die morphologische Veränderung der Mitochondrien während des Muskelatrophieprozesses mithilfe der Transmissionselektronenmikroskopie untersucht. Die Anzahl der Mitochondrien in denervierten Muskelgeweben war bei Myonectin-KO-Mäusen signifikant geringer als bei WT-Mäusen (Abb. 4b). Darüber hinaus war der Prozentsatz veränderter Mitochondrien, die eine mitochondriale Dysfunktion aufweisen, in denervierten Muskelgeweben bei Myonectin-KO-Mäusen signifikant höher als bei WT-Mäusen (Abb. 4b). Konsistent war die Citrat-Synthase-Aktivität, die ein Marker für die intakte Mitochondrienfunktion ist, in der isolierten Mitochondrienfraktion aus dem Gastrocnemius-Muskel bei Myonectin-KO-Mäusen niedriger als bei WT-Mäusen (Abb. 4c). Darüber hinaus war die Expression von Mitochondrienkomplex I und Komplex II in isolierten Mitochondrienfraktionen aus dem Gastrocnemius-Muskel bei Myonectin-KO-Mäusen geringer als bei WT-Mäusen (Abb. 4d). Somit könnte Myonektin eine Schutzfunktion gegen mitochondriale Dysfunktion ausüben, die durch Muskelatrophie verursacht wird.

Um den genauen Mechanismus aufzuklären, durch den Myonektin Muskelatrophie verhindert, wurden C2C12-Myotubes zur Analyse verwendet. Wir untersuchten die Wirkung von Myonectin auf die DEX-induzierte Myotube-Atrophie. Die Behandlung mit Myonectin-Protein stellte die DEX-induzierte Verringerung des Myotube-Durchmessers wieder her (Abb. 5a). Die Behandlung von C2C12-Myotubes mit Myonectin erhöhte die Expressionsniveaus von PGC1α, PGC1α4 und IGF1 in Gegenwart oder Abwesenheit von DEX (Abb. 5b). Darüber hinaus erhöhte die Behandlung von C2C12-Myotubes mit Myonectin-Protein zeitabhängig die Expressionsniveaus von PGC1α und die Phosphorylierungsniveaus von AMPK und Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC) (Abb. 5c). Um zu klären, ob die Wirkung von Myonectin durch den AMPK/PGC1α-abhängigen Weg vermittelt wurde, wurden C2C12-Myotubes mit adenoviralen Vektoren transduziert, die eine dominant-negative Mutante von AMPK (Ad-dnAMPK) oder Kontroll-β-Galactosidase (Ad-β-gal) exprimierten. Die Transduktion von C2C12-Myotubes mit Ad-dnAMPK unterdrückte die Myonektin-stimulierte Phosphorylierung von ACC, einem Downstream-Signal von AMPK (Abb. 5d). Die Transduktion mit Ad-dnAMPK verringerte die durch Myonektin verstärkte Expression von PGC1α in C2C12-Myotubes (Abb. 5d). Bemerkenswert ist, dass die Ad-dnAMPK-Behandlung den Myonectin-induzierten Anstieg des Myotube-Durchmessers in Gegenwart von DEX umkehrte (Abb. 5e).

a, b C2C12-Myotubes wurden 1 Stunde lang mit Myonectin-Protein (5 µg/ml) oder Vehikel vorbehandelt, gefolgt von einer 24-stündigen Stimulation mit DEX (100 µM) oder Vehikel. a Die oberen Felder zeigen repräsentative Bilder von Myotubes. Maßstabsbalken zeigen 200 μm. Das untere Feld zeigt die Quantifizierung des Myotube-Durchmessers. N = 5 in jeder Gruppe. b Die oberen Felder zeigen repräsentative Western-Blot-Analysen von PGC1α, PGC1α4, IGF1 und Tubulin. Die unteren Felder zeigen die Quantifizierung der auf das Tubulinsignal normalisierten PGC1α-, PGC1α4- und IGF1-Signale. N = 4 in jeder Gruppe. c C2C12-Myotubes wurden für die angegebene Zeitspanne mit Myonectin-Protein (5 µg/ml) oder Vehikel behandelt. Die linken Felder zeigen repräsentative Western-Blot-Analysen von pAMPK, AMPK, pACC, ACC, PGC1α und Tubulin. Die rechten Grafiken zeigen quantitative Analysen der pAMPK/Tubulin-, pACC/Tubulin- und PGC1α/Tubulin-Signalverhältnisse. N = 4 in jeder Gruppe. d, e C2C12-Myotubes wurden 24 Stunden vor der Myonectin-Behandlung mit adenoviralen Vektoren vorbehandelt, die die dominant-negative mutierte Form von AMPKα2 exprimierten, markiert mit Myc (Ad-dnAMPK) oder Kontroll-Ad-β-gal. d C2C12-Myotubes wurden 1 Stunde lang mit Myonectin-Protein (5 µg/ml) oder Vehikel behandelt. Die linken Felder zeigen repräsentative Western Blots von pACC, ACC, PGC1α, Myc-Tag und Tubulin. Die rechten Felder zeigen quantitative Analysen der pACC/Tubulin- und PGC1α/Tubulin-Signalverhältnisse. N = 3 in jeder Gruppe. Die C2C12-Myotubes wurden 1 Stunde lang mit Myonectin-Protein (5 µg/ml) oder Vehikel vorbehandelt, gefolgt von einer 24-stündigen Stimulation mit DEX (100 µM) oder Vehikel. Die oberen Felder zeigen repräsentative Bilder von Myotubes. Maßstabsbalken zeigen 200 μm. Das untere Feld zeigt die Quantifizierung des Myotube-Durchmessers. N = 4 in jeder Gruppe. f C2C12-Myotubes wurden 24 Stunden vor der Myonectin-Behandlung mit siRNA transduziert, die auf PGC1α abzielte, oder mit nicht verwandter Kontroll-siRNA. Die oberen Felder zeigen repräsentative Bilder von Myotubes. Das untere Feld zeigt die Quantifizierung des Myotube-Durchmessers. N = 4 in jeder Gruppe. Maßstabsbalken zeigen 200 μm. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Es wurde eine einfaktorielle ANOVA mit einer Post-hoc-Analyse für a–f durchgeführt. DEX, Dexamethason. Ad-dnAMPK Adenovirus-Vektoren, die das Gen für dominant-negatives AMPKα2 enthalten, Ad-β-gal Adenovirus-Vektoren, die das Gen für β-Galactosidase enthalten.

Die AMPKα-Untereinheit hat zwei Isoformen, α1 und α215. Um die isoformspezifische Rolle von AMPKα bei der Regulierung der PGC1α- und PGC1α4-Expression zu untersuchen, wurden C2C12-Myotubes mit siRNA transfiziert, die auf AMPKα1 oder AMPKα2 abzielt, oder mit nicht verwandter Kontroll-siRNA. Die Behandlung von C2C12-Myotubes mit siRNA, die auf AMPKα1 und AMPKα2 abzielt, reduzierte die Expression von AMPKα1 und AMPKα2 um 76,1 ± 1,3 % bzw. 87,8 ± 1,0 % im Vergleich zur Kontroll-siRNA-Behandlung (ergänzende Abbildung 9a). Der Abbau von AMPKα1 hatte keinen Einfluss auf die Myonectin-stimulierten Erhöhungen der PGC1α- und PGC1α4-Expression in C2C12-Myotubes (ergänzende Abbildung 9b). Wichtig ist, dass durch die Ablation von AMPKα2 der durch Myonektin stimulierte Anstieg der PGC1α- und PGC1α4-Expression in C2C12-Myotubes aufgehoben wurde (ergänzende Abbildung 9c). Darüber hinaus wurden C2C12-Myotubes mit siRNA transfiziert, die auf PGC1α abzielte, oder mit nicht verwandter Kontroll-siRNA. Die Behandlung von C2C12-Myotubes mit siRNA, die auf PGC1α abzielt, reduzierte die Expression von PGC1α und PGC1α4 um 75,5 ± 2,4 % bzw. 75,8 ± 4,9 % im Vergleich zur Kontroll-siRNA-Behandlung (ergänzende Abbildung 10a). Durch den Abbau von PGC1α wurde der Myonektin-vermittelte Anstieg des Myotube-Durchmessers in Gegenwart von DEX aufgehoben (Abb. 5f). Darüber hinaus kehrte die Ablation von PGC1α den durch Myonektin stimulierten Anstieg der IGF1-Expression in C2C12-Myotubes in Gegenwart von DEX um (ergänzende Abbildung 10b).

Um zu untersuchen, ob eine Überexpression von PGC1α4 die durch AMPK-Inaktivierung verursachte Verringerung der Anti-Atrophie-Wirkung von Myonektin retten könnte, wurden C2C12-Myotubes mit adenoviralen Vektoren transduziert, die PGC1α4 (Ad-PGC1α4) exprimierten oder Ad-βgal in Gegenwart oder Abwesenheit von Ad-dnAMPK kontrollierten. Die Behandlung von C2C12-Myotubes mit Ad-PGC1α4 erhöhte die Proteinspiegel von PGC1α4 (ergänzende Abbildung 11a). Die Behandlung mit Ad-PGC1α4 kehrte die unterdrückenden Wirkungen der AMPK-Inaktivierung auf die Myonektin-induzierte Zunahme des Myotube-Durchmessers in Gegenwart von DEX um (ergänzende Abbildung 11b). Diese Daten deuten darauf hin, dass Myonectin über den AMPKα2/PGC1α4-abhängigen Weg vor DEX-induzierter Myotubenatrophie schützen könnte.

Um die therapeutische Wirkung von Myonectin auf Muskelatrophie zu beurteilen, wurde dem Gastrocnemius-Muskel von WT-Mäusen rekombinantes Myonectin-Protein unter Verwendung von Gelatine-Hydrogel unmittelbar nach der chirurgischen Denervierung nachhaltig verabreicht. Die Verabreichung von Myonectin an WT-Mäuse erhöhte die durch das Körpergewicht normalisierten Gastrocnemius-Muskelgewichte nach der Denervierung auf das Niveau des nicht denervierten Gastrocnemius-Muskels (Abb. 6a). Die Behandlung von WT-Mäusen mit Myonectin hatte im Vergleich zur Vehikelbehandlung keinen Einfluss auf das Körpergewicht nach der Denervierung (ergänzende Abbildung 12a). Das Gewicht des denervierten Gastrocnemius-Muskels schien bei mit Myonektin behandelten WT-Mäusen höher zu sein als bei mit Vehikel behandelten WT-Mäusen, dies war jedoch statistisch nicht signifikant. Es gab keine signifikanten Unterschiede im Gewicht des nicht denervierten Gastrocnemius-Muskels zwischen mit Vehikel behandelten WT- und Myonektin-behandelten WT-Mäusen.

AC-WT-Mäuse im Alter von 8–10 Wochen wurden einer durch Ischias-Denervierung induzierten Muskelatrophie-Operation unterzogen. Mit rekombinantem Myonektin (12 µg) oder Vehikel imprägniertes Gelatinehydrogel wurde kurz vor der Denervierung in die Faszie des denervierten Gastrocnemius-Muskels injiziert. 5 Tage nach der Denervierung des Ischiasnervs wurden die denervierten und nicht denervierten Gastrocnemius-Muskeln von mit Myonektin oder Vehikel behandelten WT-Mäusen zur Analyse verwendet. a Gastrocnemius-Muskelgewicht/Körpergewicht-Verhältnis von mit Myonektin oder Vehikel behandelten WT-Mäusen. N = 5 in jeder Gruppe. b Die linken Felder zeigen repräsentative Querschnittsbilder der Muskelfasern von mit Myonektin oder Vehikel behandelten WT-Mäusen. Maßstabsbalken zeigen 100 μm. Die rechten Felder zeigen quantitative Analysen der mittleren Querschnittsfläche (CSA) und der CSA-Verteilung des Gastrocnemius-Muskels bei mit Myonektin oder Vehikel behandelten WT-Mäusen. N = 5 in jeder Gruppe. c Die linken Felder zeigen repräsentative Western-Blot-Analysen von pAMPK, AMPK, PGC1α, PGC1α4 und Tubulin. Die rechten Felder zeigen quantitative Analysen der PGC1α-, PGC1α4- und pAMPK-Signale, normalisiert auf das Tubulinsignal. N = 5 in jeder Gruppe. d, e WT- und DN-AMPK-Tg-Mäuse wurden nach 8–10 Wochen einer durch Ischias-Denervierung induzierten Atrophieoperation unterzogen. Mit rekombinantem Myonektin (12 µg) oder Vehikel imprägniertes Gelatinehydrogel wurde kurz vor der Denervierung in die Faszie des denervierten Gastrocnemius-Muskels injiziert. 5 Tage nach der Denervierung des Ischiasnervs wurden WT- und DN-AMPK-Tg-Mäuse getötet und denervierte und nicht-denervierte Gastrocnemius-Muskeln für die Analyse verwendet. d Die linken Felder zeigen repräsentative Western-Blot-Analysen von PGC1α, PGC1α4, IGF1 und Tubulin. Das rechte Feld zeigt quantitative Analysen der PGC1α-, PGC1α4- und IGF1-Signale, normalisiert auf das Tubulinsignal. N = 6 in jeder Gruppe. e Das Verhältnis des Gastrocnemius-Muskels zum Körpergewicht bei mit Myonektin oder Vehikel behandelten WT- und DN-AMPK-Tg-Mäusen. N = 6 in jeder Gruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Es wurden ein zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test (c) und eine einfaktorielle ANOVA mit einer Post-hoc-Analyse (a, b, d, e) durchgeführt. Gastroc. Gastrocnemius-Muskel, BW-Körpergewicht, V-Vehikel, M-Myonektin, DN-AMPK Tg-transgene Mäuse, die die dominant negative mutierte Form von AMPK durch eine Kontrolle des Skelettmuskel-spezifischen menschlichen α-Skelett-Aktin (HSA)-Promotors überexprimieren.

In der histologischen Analyse erhöhte die Behandlung von WT-Mäusen mit Myonektin den mittleren CSA des denervierten Gastrocnemius-Muskels signifikant (Abb. 6b). Die Behandlung von WT-Mäusen mit Myonectin erhöhte die Häufigkeit größerer CSA des denervierten Gastrocnemius-Muskels. Die Myonectin-Behandlung hatte keine Auswirkungen auf das Gewicht des Gastrocnemius-Muskels und den CSA des Muskels bei nicht denervierten WT-Mäusen. Die Myonectin-Behandlung erhöhte den mittleren CSA der Typ-II-Muskelfasern im Gastrocnemius-Muskel bei denervierten WT-Mäusen signifikant (ergänzende Abbildung 13a, b). Die Behandlung mit Myonectin induzierte eine größere Größenverteilung der Typ-II-Faser-CSA des Gastrocnemius-Muskels bei denervierten WT-Mäusen (ergänzende Abbildung 13b). Im Gegenteil, die Behandlung mit Myonektin hatte keinen Einfluss auf die mittlere CSA der Typ-I-Muskelfasern und deren Verteilung im Gastrocnemius-Muskel bei denervierten WT-Mäusen (ergänzende Abbildungen 14a und 13b). Die Behandlung mit Myonectin hatte keine Auswirkungen auf die Häufigkeit von Typ-I-Fasern im Gastrocnemius-Muskel bei denervierten WT-Mäusen (ergänzende Abbildung 13c). Darüber hinaus erhöhte die Verabreichung von Myonektin einen Tag nach der Denervierung die durch das Körpergewicht normalisierten Gastrocnemius-Muskelgewichte bei WT-Mäusen signifikant (ergänzende Abbildung 14). Daher deuten diese Daten darauf hin, dass eine Myonectin-Supplementierung therapeutisch wirksam bei der Verbesserung der Muskelatrophie sein kann.

In Übereinstimmung mit den in Experimenten zum Funktionsverlust beobachteten Daten erhöhte die Behandlung mit Myonektin die Proteinspiegel von PGC1α und PGC1α4 sowie den Phosphorylierungsgrad von AMPK in den Gastrocnemius-Muskeln nach der Denervierung (Abb. 6c). Um zu beurteilen, ob AMPK an der positiven Wirkung von Myonectin auf die Muskelatrophie beteiligt ist, wurden transgene Mäuse verwendet, die die dominant negative mutierte Form von AMPK unter der Kontrolle des skelettmuskelspezifischen humanen α-Skelett-Aktin (HSA)-Promotors (DN-AMPK Tg) überexprimieren Analyse. Im Gegensatz zu WT-Mäusen wurden die stimulierenden Wirkungen von Myonectin auf die Proteinspiegel von PGC1α, PGC1α4 und IGF1 im Gastrocnemius-Muskel nach der Denervierung bei DN-AMPK-Tg-Mäusen nicht beobachtet (Abb. 6d). In ähnlicher Weise hatte Myonectin nach Denervierung bei DN-AMPK-Tg-Mäusen nur geringe Auswirkungen auf das Gastrocnemius-Muskelgewicht pro Körpergewicht (Abb. 6e). Darüber hinaus wurde Ad-dnAMPK oder Ad-β-gal 3 Tage vor der Myonectin-Behandlung intramuskulär in den Gastrocnemius-Muskel von WT-Mäusen verabreicht. Obwohl die Myonectin-Behandlung das Gastrocnemius-Muskelgewicht pro Körpergewicht von mit Ad-β-gal behandelten WT-Mäusen nach der Denervierung erhöhte, hatte sie keine Auswirkungen auf das Gastrocnemius-Muskelgewicht pro Körpergewicht von mit Ad-dnAMPK behandelten WT-Mäusen nach der Denervierung (ergänzende Abbildung 15). ). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Behandlung mit Myonektin über den AMPK/PGC1α-abhängigen Weg vor Muskelatrophie schützt.

Um die Wirkung von Myonectin auf die altersbedingte Sarkopenie zu bewerten, wurden 8-Mäuse mit Seneszenz-beschleunigter Mausneigung (SAMP), die einen Phänotyp des beschleunigten Alterns aufweisen, im Alter von einer intramuskulären Verabreichung von Ad-Myonectin oder Kontroll-Ad-β-Gal unterzogen 33 Wochen. Die Myonectin-Proteinspiegel im Gastrocnemius-Muskelgewebe waren bei SAMP8-Mäusen im Vergleich zu Kontroll-SAMR1-Mäusen im Alter von 37 Wochen signifikant verringert (ergänzende Abbildung 16a). Die Behandlung von SAMP8-Mäusen mit Ad-Myonectin erhöhte die Expressionsniveaus von Myonectin im Gastrocnemius-Muskel im Vergleich zur Ad-β-Gal-Behandlung um den Faktor 3,4 ± 0,5 (ergänzende Abbildung 16b). 4 Wochen nach der Verabreichung von Ad-β-gal oder Ad-myonectin waren die Gastrocnemius-Muskelgewichte pro Körpergewicht bei mit Ad-myonectin behandelten SAMP8-Mäusen signifikant höher als bei mit Ad-β-gal behandelten SAMP8-Mäusen (Abb. 7a). Das Körpergewicht unterschied sich nicht zwischen mit Ad-β-gal behandelten und mit Ad-Myonectin behandelten SAMP8-Mäusen (ergänzende Abbildung 12b). Das Gewicht des Gastrocnemius-Muskels von mit Ad-Myonectin behandelten SAMP8-Mäusen schien im Vergleich zu dem von mit Ad-β-gal behandelten SAMP8-Mäusen erhöht zu sein, dies war jedoch statistisch nicht signifikant.

a–c Ad-Myonectin (Myonectin) oder Ad-β-Gal (Kontrolle) wurde SAMP8-Mäusen im Alter von 33 Wochen intramuskulär injiziert. 4 Wochen nach der Behandlung mit Myonectin oder der Kontrolle wurden SAMP8-Mäuse getötet und die Gastrocnemius-Muskeln zur Analyse verwendet. ein Gastrocnemius-Muskelgewicht/Körpergewicht-Verhältnis von mit Myonektin behandelten oder mit Kontrolle behandelten SAMP8-Mäusen. N = 5 bei SAMP8-Mäusen vor der Behandlung. N = 7 bei SAMP8-Mäusen nach Myonektin- oder Kontrollbehandlung. b Die oberen linken Felder zeigen repräsentative Bilder von Muskelfasern von SAMP8-Mäusen vor oder nach der Behandlung mit Myonectin oder Kontrolle. Maßstabsbalken zeigen 100 μm. Die unteren Felder zeigen die Quantifizierung der mittleren Querschnittsfläche (CSA) und der CSA-Verteilung von SAMP8-Mäusen vor oder nach der Behandlung mit Myonectin oder Kontrolle. N = 5 in jeder Gruppe. c Die linken Felder zeigen repräsentative Western-Blot-Analysen von PGC1α, PGC1α4 und Tubulin in SAMP8-Mäusen vor oder nach der Behandlung mit Myonectin oder Kontrolle. Die rechten Grafiken zeigen quantitative Analysen der PGC1α/Tubulin- und PGC1α4/Tubulin-Signalverhältnisse. N = 5 in jeder Gruppe. d–f Ad-Myonectin (Myonectin) oder Ad-β-Gal (Kontrolle) wurde im Alter von 4 Wochen in die Gastrocnemius-Muskeln von mdx-Mäusen injiziert. 4 Wochen nach der Behandlung mit Myonectin oder der Kontrolle wurden mdx-Mäuse getötet. d Gastrocnemius-Muskelgewicht/Körpergewicht-Verhältnis von mit Myonektin behandelten oder mit Kontrolle behandelten mdx-Mäusen. N = 5 in jeder Gruppe. e Die oberen Felder zeigen repräsentative Bilder von Muskelfasern von mit Myonektin behandelten oder mit Kontrolle behandelten mdx-Mäusen. Maßstabsbalken zeigen 100 μm. Die unteren Felder zeigen eine quantitative Analyse des mittleren CSA und der CSA-Verteilung von mit Myonectin behandelten oder mit Kontrolle behandelten mdx-Mäusen. N = 5 in jeder Gruppe. f Die linken Felder zeigen repräsentative Western-Blot-Analysen von PGC1α, PGC1α4 und Tubulin. Die rechten Grafiken zeigen quantitative Analysen der PGC1α/Tubulin- und PGC1α4/Tubulin-Signalverhältnisse von mit Myonectin behandelten oder mit Kontrolle behandelten mdx-Mäusen. N = 5 in jeder Gruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Einfaktorielle ANOVA mit einer Post-hoc-Analyse für a–c. Zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test für d–f. Gastroc. Gastrocnemius-Muskel, BW-Körpergewicht, SAMP8-Seneszenz beschleunigte Maus, anfällig für 8, Ad-β-gal Adenovirale Vektoren, die das Gen für β-Galactosidase enthalten, Ad-Myonectin Adenovirus-Vektoren, die das Gen für Myonectin enthalten.

Die histologische Analyse ergab auch, dass die Behandlung mit Ad-Myonectin den mittleren CSA des Gastrocnemius-Muskels bei SAMP8-Mäusen im Vergleich zur Behandlung mit Ad-β-gal erhöhte (Abb. 7b). Die Behandlung mit Ad-Myonectin erhöhte auch die Proteinspiegel von PGC1α und PGC1α4 im Gastrocnemius-Muskel bei SAMP8-Mäusen (Abb. 7c).

Schließlich untersuchten wir die Wirkung von Myonectin auf die Muskelatrophie bei mdx-Mäusen, einem genetischen Muskeldystrophiemodell. Die Myonectin-Proteinspiegel im Gastrocnemius-Muskel waren bei mdx-Mäusen im Vergleich zu Kontroll-WT-Mäusen im Alter von 8 Wochen signifikant verringert (ergänzende Abbildung 17a). Mdx-Mäuse wurden im Alter von 4 Wochen einer intramuskulären Verabreichung von Ad-β-gal oder Ad-myonectin unterzogen. Die Behandlung von mdx-Mäusen mit Ad-Myonectin erhöhte die Expressionsniveaus von Myonectin im Gastrocnemius-Muskel im Vergleich zur Ad-β-Gal-Behandlung um den Faktor 3,7 ± 0,4 (ergänzende Abbildung 17b). 4 Wochen nach der Verabreichung von Ad-β-gal oder Ad-myonectin waren die Gastrocnemius-Muskelgewichte pro Körpergewicht bei mit Ad-myonectin behandelten mdx-Mäusen signifikant höher als bei mit Ad-β-gal behandelten mdx-Mäusen (Abb. 7d). Das Körpergewicht unterschied sich nicht zwischen mit Ad-β-gal behandelten und mit Ad-Myonectin behandelten mdx-Mäusen (ergänzende Abbildung 12c). Das Gewicht des Gastrocnemius-Muskels war bei mit Ad-Myonectin behandelten mdx-Mäusen tendenziell höher als bei mit Ad-β-gal behandelten mdx-Mäusen, dies war jedoch statistisch nicht signifikant.

Die histologische Analyse zeigte, dass die Behandlung mit Ad-Myonectin die CSA des Gastrocnemius-Muskels bei mdx-Mäusen im Vergleich zur Behandlung mit Ad-β-gal erhöhte (Abb. 7E). Die Proteinspiegel von PGC1α und PGC1α4 im Gastrocnemius-Muskel von mdx-Mäusen wurden durch die Behandlung mit Ad-Myonectin ebenfalls erhöht (Abb. 7f). Darüber hinaus führte die Behandlung von mdx-Mäusen mit Ad-Myonectin zu einer erhöhten Expression der schweren Kette von embryonalem Myosin (Myh3) und einer Häufigkeit zentraler kernpositiver Zellen im Gastrocnemius-Muskelgewebe, was auf eine Förderung der Skelettmuskelregeneration hinweist (ergänzende Abbildung 17c). , D). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Behandlung mit Myonektin bei der Linderung verschiedener Arten von Muskelschwund, einschließlich altersbedingter Sarkopenie und genetischer Muskeldystrophie, wirksam sein könnte.

In der vorliegenden Studie haben wir den Beweis erbracht, dass Myonektin als Modulator der Skelettmuskelmasse und -funktion fungiert. Ältere Mäuse zeigten eine deutliche Verringerung der Myonektinexpression in der Skelettmuskulatur. Ein Myonektinmangel führte bei älteren Mäusen zu einer verstärkten Atrophie der Skelettmuskulatur, insbesondere der Muskelfasern vom Typ II, was mit einer Verringerung der Muskelkraft und der körperlichen Leistungsfähigkeit einherging. Ein Myonektinmangel führte auch in Modellen zur durch Denervierung des Ischias oder durch DEX induzierten Muskelatrophie zu einer verstärkten Atrophie der Skelettmuskulatur. Umgekehrt verbesserte die Verabreichung von Myonectin einen Tag oder unmittelbar nach der Denervierung die Muskelatrophie bei Mäusen. In-vitro-Experimente zeigten auch, dass Myonectin die DEX-induzierte Myofaseratrophie umkehrte. Darüber hinaus verbesserte die intramuskuläre Verabreichung von Myonectin das spontane Fortschreiten der Muskelatrophie in SAMP8-Mausmodellen für beschleunigtes Altern oder mdx-Mausmodellen für Muskeldystrophie. Daher deuten mehrere Belege darauf hin, dass Myonektin als Schutzfaktor gegen Funktionsstörungen der Skelettmuskulatur wirken kann, was darauf hindeutet, dass Myonektin ein therapeutisches Ziel für Muskelatrophie darstellen kann.

Mitochondriale Dysfunktionen sind an Erkrankungen der Skelettmuskulatur wie Sarkopenie16 beteiligt. Bewegungstraining fördert die Mitochondrienfunktion der Skelettmuskulatur und kommt der Vorbeugung oder Behandlung verschiedener chronischer Erkrankungen zugute, darunter Stoffwechselstörungen und Sarkopenie17. PGC1α ist ein Transkriptionskoregulator, der durch körperliches Training induziert wird und den mitochondrialen Energiestoffwechsel steuert18,19. Transgene PGC1α-Mäuse zeigen eine aktivierte mitochondriale Biogenese im Skelettmuskel und eine erhöhte Ermüdungsresistenz20. Ein PGC1α-Mangel führt zu verstärkten Anomalien der mitochondrialen Struktur und Funktion sowie einer verminderten Trainingsleistung21,22. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Myonektinmangel zur Reduzierung des PGC1α-abhängigen Signalwegs und zur Verschlimmerung der mitochondrialen Dysfunktion und Myofaseratrophie in denervierten Skelettmuskeln bei Mäusen beiträgt. Ein Myonektinmangel ist auch an der Verstärkung der Atrophie der Skelettmuskulatur und der Verringerung der Muskelkraft und der körperlichen Leistungsfähigkeit bei älteren Mäusen beteiligt. Diese Ergebnisse legen daher nahe, dass Myonectin zumindest teilweise durch Modulation der PGC1α-abhängigen Mitochondrienfunktion vor Muskeldysfunktionen schützt.

PGC1α im Skelettmuskel wird durch AMPK, zyklisches AMP (cAMP)/cAMP-Response-Element-Bindungsprotein (CREB) und Calmodulin-abhängige Kinasewege nach dem Training aktiviert23,24,25. Die Behandlung von Mäusen mit AICAR, einem Aktivator von AMPK, führt zu einer verbesserten Laufausdauer, die mit einer erhöhten Expression von PGC1α in der Skelettmuskulatur einhergeht26. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen deuten unsere vorliegenden Ergebnisse darauf hin, dass AMPK nach der Behandlung mit Myonektin als Vorläufer von PGC1α im Skelettmuskel fungiert. Daher ist es denkbar, dass Myonectin die Dysfunktion der Skelettmuskulatur durch den AMPK/PGC1α-abhängigen Mechanismus verbessern kann. Über den Mechanismus, wie Myonektin den AMPK-Signalweg aktiviert, ist derzeit noch nichts bekannt, und dies bedarf weiterer Untersuchungen.

Berichten zufolge induziert PGC1α4 eine Hypertrophie der Skelettmuskulatur, teilweise über die Regulierung der IGF1-Expression14. Unsere vorliegenden Daten dokumentieren, dass Myonektin die Proteinexpression von PGC1α4 und IGF1 im Skelettmuskel und in C2C12-Myotubes positiv reguliert. Es wurde gezeigt, dass AMPKα2 die PGC1α4-Expression in C2C12-Zellen reguliert15. Unsere Gen-Knockdown-Experimente zeigten übereinstimmend, dass Myonectin die PGC1α4-Expression in C2C12-Myotubes über den AMPKα2-abhängigen Weg erhöht. Darüber hinaus verstärkt Myonectin die Expression von PGC1α4 und IGF1 im Skelettmuskel in vivo über den AMPK-abhängigen Weg. Daher ist es wahrscheinlich, dass Myonektin die PGC1α4-Proteinexpression im Skelettmuskel durch Aktivierung von AMPKα2 erhöht. Darüber hinaus blockiert der siRNA-vermittelte Abbau von PGC1α, der auch die PGC1α4-Expression reduziert, die Anti-Atrophie-Wirkung von Myonectin in C2C12-Myotubes. Darüber hinaus rettet die Überexpression von PGC1α4 die durch die AMPK-Inaktivierung induzierte Verringerung der Myotube-Anti-Atrophie-Wirkung von Myonektin. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Myonectin durch die AMPKα2/PGC1α4/IGF-1-abhängigen Mechanismen Muskelatrophie zumindest teilweise verhindern könnte.

Ausdauertraining ist wirksam bei der Reduzierung des Risikos für Herz-Kreislauf-Erkrankungen27,28. Es wurde berichtet, dass Myonektin die Adipogenese und die Ansammlung von Fettgewebe negativ reguliert6,8. Kürzlich haben wir gezeigt, dass Myonectin die myokardiale Ischämie-Reperfusionsschädigung bei Mäusen verbessert9. Bemerkenswert ist, dass wir auch gezeigt haben, dass Ausdauertraining die Myonektinspiegel in der Skelettmuskulatur und im Blutkreislauf erhöht und dass Myonektin die positiven Auswirkungen von Ausdauertraining auf ischämische Herzen vermittelt. Unsere vorliegenden Daten deuten darauf hin, dass Myonectin die AMPK/PGC1α-Signale in der Skelettmuskulatur positiv reguliert, was durch Ausdauertraining aktiviert werden kann. Zusammengefasst deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Behandlung mit Myonektin die heilsamen Wirkungen von Ausdauertraining bei einer Reihe pathologischer Erkrankungen nachahmen könnte.

Muskelschwund, der durch Inaktivität verursacht wird, kann während der gesamten menschlichen Lebensspanne auftreten und die Lebensqualität beeinträchtigen29. Die PGC1α-Expressionswerte nehmen als Reaktion auf Denervierung oder Nichtbeanspruchung der Skelettmuskulatur deutlich ab, und die Aufrechterhaltung der PGC1α-Werte führt zum Schutz vor Muskelatrophie. Unsere In-vivo-Ergebnisse deuten darauf hin, dass Myonectin durch seine Fähigkeit, die PGC1α-Expression zu erhöhen, die durch Denervierung verursachte Muskelatrophie lindern kann. Eine durch Glukokortikoide verursachte Muskelatrophie ist ebenfalls mit einer verminderten Lebensqualität verbunden und stellt eines der schwerwiegenden sozialen Probleme dar. Steroidmedikamente, einschließlich DEX, induzieren eine Skelettmuskelatrophie durch Glukokortikoidrezeptor-vermittelte Aktivierung von FoxO, Atrogin-1 und MuRF-130,31. Darüber hinaus schwächt DEX die PGC1α-Expression in L6-Myotubes ab, indem es den CREB-regulierten Transkriptionskoaktivator 2 reduziert, der ein positiver Regulator von PGC1α32 ist. Unsere Gen-Knockdown-Experimente zeigten, dass die unterdrückende Wirkung von Myonectin auf die Myofaseratrophie teilweise von seiner Fähigkeit abhängt, die PGC1α-Expression zu induzieren. Diese Ergebnisse legen daher nahe, dass Myonectin die durch Nichtgebrauch und Steroidgebrauch verursachte Muskelatrophie durch Hochregulierung der PGC1α-Expression verbessern könnte.

Die Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine früh fortschreitende und lebensbedrohliche Erkrankung. In der frühen Kindheit leiden DMD-Patienten unter den Symptomen einer Muskelschwäche, die schließlich im Alter von 8 bis 12 Jahren zum Verlust der Gehfähigkeit führt. In jüngster Zeit wurden Exon-Skipping-Therapien entwickelt, die die Symptome von DMD-Patienten mit DMD wirksam lindern können Mutation von Dystrophin, anwendbar auf Exon-Skipping-Methoden33. Andererseits sind die meisten DMD-Patienten mit der Dystrophin-Mutation nicht auf Exon-Skipping-Methoden anwendbar34. In der vorliegenden Studie haben wir herausgefunden, dass die Behandlung mit Myonektin das Fortschreiten der Muskeldystrophie bei mdx-Mäusen, einem Mausmodell für DMD, abschwächt. Es wurde berichtet, dass mit mdx-Mäusen gekreuzte skelettmuskelspezifische PGC1α-transgene Mäuse im Vergleich zu mdx-Mäusen eine verbesserte Muskelatrophie, Laufleistung und Plasma-Kreatinkinase-Werte aufweisen35. Darüber hinaus übt die vorübergehende Überexpression von PGC1α im Skelettmuskel durch Plasmidtransfektion heilsame Wirkungen auf die Mitochondrienfunktion in mdx-Mäusen aus36. Daher deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Myonectin Muskeldystrophie von mdx-Mäusen durch PGC1α-stimulierte mitochondriale Biogenese verhindern könnte, was darauf hindeutet, dass Myonectin ein potenzielles therapeutisches Ziel für DMD darstellen könnte.

Zusammenfassend ist unsere vorliegende Studie der Bericht, dass Myonektin als Schutzfaktor für Funktionsstörungen der Skelettmuskulatur dient, die durch verschiedene pathophysiologische Zustände verursacht werden, wie z. B. altersbedingte, durch Nichtgebrauch oder Steroide verursachte Muskelatrophie. Da die Myonektinexpression in der Skelettmuskulatur im Zusammenhang mit verschiedenen Muskelschwundzuständen deutlich reduziert war, könnten die Ansätze zur Steigerung der Myonektinproduktion in funktionsgestörten Muskeln potenziell wertvoll für die Vorbeugung oder Behandlung altersbedingter Skelettmuskelatrophie sein.

Antikörper gegen phosphoryliertes AMPK (Thr172) (Kat. 2531 S) (1:1000 verdünnt), AMPK (Kat. 2532 S) (1:1000 verdünnt), phosphoryliertes ACC (Ser79) (Kat. 3661) (1:1 verdünnt). :1000), ACC (Kat. 3662) (1:1000 verdünnt), COX4 (Kat. 4844) (1:1000 verdünnt) und α-Tubulin (Kat. 2144 S) (1:1000 verdünnt) gekauft von Cell Signaling Technology. Antikörper gegen AMPKα1 (Kat. ab3759) (1:1000 verdünnt), AMPKα2 (Kat. ab3760) (1:1000 verdünnt) und Gesamt-OXPHOS (Kat. ab110413) (1:500 verdünnt) wurden von Abcam erworben. Antikörper gegen Myonectin wurden von Santa Cruz Biotechnology (Kat. sc-246565) erworben (verdünnt im Verhältnis 1:2500). Antikörper gegen IGF1 (Kat. AF-791) wurden von R&D Systems, Inc. gekauft (verdünnt im Verhältnis 1:500). Antikörper gegen PGC1α (PGC1α und PGC1α4) wurden von Calbiochem (Kat. ST1202-1SETCN) erworben. Monoklonales Anti-Slow-Myosin der Maus (Klon NOQ7.5.4D) (Kat. SAB4200670) (1:10.000 verdünnt) und monoklonales Anti-Fast-Myosin der Maus (Klon MY-32) (Kat. M4276) (1:800 verdünnt) wurden von Sigma gekauft. Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-HRP-gebundener Antikörper (Kat. 7074) und Pferde-Anti-Maus-IgG-HRP-gebundener Antikörper (Kat. 7076) wurden von Cell Signaling Technology erworben (verdünnt im Verhältnis 1:5000). Rinder-Anti-Ziegen-IgG-HRP-gebundener Antikörper (Kat. sc-2384) wurde von Santa Cruz gekauft (verdünnt im Verhältnis 1:2000). Biologisch abbaubares Gelatinehydrogel wurde von Nitta Gelatin Inc. gekauft. Dexamethason (DEX) wurde von Cayman Chemical Co. gekauft. Rekombinantes Maus-Myonectin-Protein wurde unter Verwendung eines Säugetier-Expressionsvektors hergestellt, der für Maus-Myonectin (Fam132b) cDNA9 in voller Länge kodiert.

Unter der Kontrolle des CMV-Promotors wurden adenovirale Vektoren konstruiert, die Maus-Myonectin in voller Länge (Ad-Myonectin), Maus-PGC1α4 (Ad-PGC1α4) oder β-Galactosidase (Ad-β-gal) exprimieren. Adenovirale Vektoren, die die dominant negative mutierte Form von AMPKα2 (Ad-dnAMPK) exprimieren, wurden unter Verwendung der AMPKα2-cDNA der Ratte, deren Lysin-45-Rest durch Arginin ersetzt wurde, mit dem c-Myc-Epitop-Tag37 hergestellt.

Männliche C57BL/6 J-Wildtyp-Mäuse (WT) wurden von SLC Co Ltd. gekauft. Myonectin (Fam132b)-Knockout-Mäuse (Myonectin-KO) wurden ursprünglich von Lexicon Pharmaceuticals, Inc. (Woodlands, TX) erzeugt und von bezogen Taconic Biosciences, Inc (NY, USA)9. Myonectin-KO-Mäuse wurden vor dem Hintergrund von C57BL/6 erzeugt und in dieser Studie wurden männliche homozygote Myonectin-KO-Mäuse verwendet. Die vom menschlichen Skelett-A-Actin-Promotor (HSA) promotorgesteuerte dominant negative mutierte Form von AMPK-transgenen (DN-AMPK Tg) männlichen Mäusen mit einem Hintergrund von C57BL/6 wurde von JCRB (Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank) Laboratory Animal Resource erworben Bank am NIBIOHN (Nationales Institut für biomedizinische Innovation, Gesundheit und Ernährung. Osaka, Japan)38. Männliche mdx-Mäuse mit einem Hintergrund von C57BL/6 wurden von Chubu Kagaku Shizai Co.,Ltd. (Nagoya, Japan) gekauft. Männliche SAMP8-Mäuse (SAMP8/TaSlc) und männliche Kontroll-SAMR1/TaSlc-Mäuse mit AKR/J-Hintergrund wurden von Japan SLC, Inc. (Hamamatsu, Japan) gekauft. Die Mäuse wurden bei 20–22 °C und 50 % relativer Luftfeuchtigkeit in einem 12-stündigen Hell/Dunkel-Zyklus gehalten. Mäuse hatten freien Zugang zu Wasser und Standardfutter (CE-2, CLEA Japan Inc.). Die Mäuse wurden zu den angegebenen Zeitpunkten nach einer Anästhesie mit Medetomidin, Midazolam und Butorphanol in Dosen von 0,15, 2,0 bzw. 2,5 mg/kg getötet. Zur histologischen und molekularen Analyse wurden Muskeln entnommen. Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Nagoya University School of Medicine genehmigt. Die Mäuse wurden genau beobachtet und schnell und zu einem humanen Endpunkt eingeschläfert (keine Fortbewegung oder ein Körpergewichtsverlust von mehr als 20 % des ursprünglichen Körpergewichts).

Zur Analyse wurden männliche WT- und Myonectin-KO-Mäuse im Alter von 80 Wochen verwendet. Die Griffstärke wurde gemessen, um die Muskelqualität mithilfe eines Kleintier-Griffstärkemessgeräts (Columbus Co., Largo, FL) zu bewerten. Die freiwillige Aktivität von Mäusen wurde mit einem Radlaufsystem (Melquest Ltd., Toyama) gemessen.

Männliche WT- und Myonectin-KO-Mäuse im Alter von 8–10 Wochen wurden kontinuierlich mit Dexamethason (DEX) behandelt, indem Alzet mini-osmotische Minipumpen (Modell 2002, Durect Corp.) 14 Tage lang auf eine Dosis von 23 µg/Tag eingestellt wurden.

Die Denervierung erfolgte durch chirurgische Entfernung des Ischiasnervs aus dem rechten Hinterbein männlicher WT-, Myonectin-KO- und DN-AMPK-Tg-Mäuse im Alter von 8–10 Wochen39. In einigen Experimenten wurde mit rekombinantem Myonektin (12 µg) imprägniertes Gelatinehydrogel kurz vor oder einen Tag nach der Denervierung in die Faszie des Gastrocnemius-Muskels injiziert. In einigen Experimenten wurde Ad-dnAMPK oder Ad-β-gal (3 × 108 Plaque-bildende Einheiten/Maus) 3 Tage vor der Denervierung in den Gastrocnemius von WT-Mäusen injiziert. Fünf Tage nach der Entfernung des Ischiasnervs wurden die Mäuse zur Analyse getötet.

Adenovirale Vektoren, die Myonectin (Ad-Myonectin) oder β-Galactosidase (Ad-β-gal) exprimieren (1 × 108 Plaque-bildende Einheiten/Maus), wurden im Alter von 4 Wochen in die Gastrocnemius-Muskeln männlicher C57BL/10-mdx-Mäuse injiziert . 4 Wochen nach der Behandlung mit Ad-Myonectin oder Ad-β-Gal wurden mdx-Mäuse zur Analyse getötet.

Ad-Myonectin oder Ad-β-Gal (1 × 108 Plaque-bildende Einheiten/Maus) wurde im Alter von 33 Wochen in die Gastrocnemius-Muskeln männlicher SAMP8- und Kontroll-SAMR1-Mäuse injiziert. 4 Wochen nach der Behandlung mit Ad-Myonectin oder Ad-β-Gal wurden SAMP8-Mäuse zur Analyse getötet.

Den Mäusen wurde erlaubt, mit den Vorderbeinen oder allen vier Gliedmaßen ein horizontales Gitter zu greifen, das mit einem Kleintier-Griffstärkemessgerät (Columbus Co., Largo, FL) verbunden war. Die Kraft, die jedes Mal auf das Gitter ausgeübt wurde, bevor das Tier den Halt verlor, wurde in Newton umkodiert. Der Durchschnitt der fünf Messungen wurde auf das Gesamtkörpergewicht normiert.

Die Mäuse wurden einzeln in einem Käfig mit Laufrad (Melquest Ltd., Toyama, Japan) gehalten. Jedes Rad verfügte über einen magnetischen Indikator und einen Hall-Effekt-Sensor, der mit einer Computerschnittstelle verbunden war und die Radumdrehungen aufzeichnete. Täglich wurden Daten zum freiwilligen Lauf des Rades (Anzahl der Umdrehungen) gesammelt und die Mäuse überprüft, um sicherzustellen, dass das Rad noch ordnungsgemäß funktionierte. Vor den Datenmessungen wurde eine fünftägige Einführungsphase vorgesehen.

Herausgeschnittenes Gastrocnemius- und Soleus-Gewebe wurde mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet. Gewebeproben wurden in einer Dicke von 6 µm geschnitten und die Schnitte mit Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbt. Der mittlere CSA der Fasern wurde mit der Image J-Software (National Institute of Health) bestimmt. Die immunhistochemische Färbung wurde mit einem monoklonalen Antikörper gegen langsames (NOQ7.5.4D, Sigma) und schnelles Skelettmyosin (MY-32, Sigma) durchgeführt.

Das RNeasy Mini-Kit (Qiagen) wurde verwendet, um Gesamt-mRNA aus Gastrocnemius-Muskeln und -Zellen zu extrahieren. cDNA wurde unter Verwendung eines ReverTra Ace-Kits (TOYOBO) synthetisiert. Die quantitative PCR-Analyse wurde mit einem BioRad-Echtzeit-PCR-Nachweissystem (TOYOBO) durchgeführt. Die qPCR-Primer sind in der Ergänzungstabelle aufgeführt. Die Expressionsniveaus der untersuchten Gene wurden durch das entsprechende Niveau von 36B4 dividiert und relativ zur Kontrolle dargestellt.

RNA-Sequenzierungsbibliotheken für jede Probe wurden mit 1 μg Gesamt-RNA unter Verwendung des Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet, und die 150-bp-Paired-End-Sequenzierung wurde auf dem Illumina NovaSeq 6000 durchgeführt. Die Datenanalyse von RNA-seq wurde durchgeführt mit einigen Modifikationen durchgeführt41. Kurz gesagt, die Qualität der Rohsequenzdaten wurde mit FastQC (Version: FastQC 0.10.0) bewertet. FASTQ-Dateien wurden mit TrimGalore auf Adapter und Phred-Score (>20) zugeschnitten! (0,6,4). Zugeschnittene sequenzierte Lesevorgänge wurden mit STAR (2.7.3a)42 an der Mausgenomassemblierung (GRCm39 GENCODE vM30) ausgerichtet. Ausgerichtete Lesevorgänge wurden zur Quantifizierung der mRNA mit HTSeq-count (Version 0.11.2)43 verwendet. Die differenzielle Genexpressionsanalyse über Proben hinweg wurde mit dem DESeq2-Paket (1.32.0) für proteinkodierende Gene durchgeführt44. Gene wurden als differenziell exprimiert ausgewählt, wenn der FDR-bereinigte p-Wert unter 0,05 lag und eine absolute log2-fache Änderung über 0,5 lag. Die Analyse wurde mit R (4.1.0) durchgeführt. Die Signalweganreicherungsanalyse der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) wurde mit dem Online-Bioinformatik-Tool Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID, v6.8) für differentiell exprimierte Gene bei einem FPKM (Fragments Per Kilobase of Kilobase of Exon) durchgeführt pro Million kartierter Fragmente) Wert von ≥1 in mindestens drei der Proben.

Skelettmuskel- und C2C12-Zellproben wurden mit Lysepuffer (Cell Signaling Technology, Kat. 9803 S) und einem Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche, Kat. 11697498001) solubilisiert. Die Proteinkonzentration wurde mit einem BCA-Protein-Assay-Kit (Thermo Scientific) bestimmt. Die gleichen Proteinmengen wurden durch denaturierende SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend auf eine PVDF-Membran (GE Healthcare) übertragen. Die Membranen wurden dem primären Antikörper ausgesetzt und anschließend mit dem HRP-konjugierten sekundären Antikörper inkubiert. Das Proteinsignal wurde mit dem ECL-Prime-System (GE Healthcare) erfasst. Die Expressionsniveaus wurden durch Messung der entsprechenden Bandenintensitäten mit der Image J-Software (National Institute of Health)45 bestimmt. Die relativen Werte der entsprechenden Bande wurden anhand der relativen Intensitäten zum α-Tubulin-Signal bewertet.

Die Gastrocnemius-Muskeln wurden in etwa 1,0 mm3 große Streifen geschnitten und 18–20 Stunden lang in einer Mischung aus 2 % Glutaraldehyd und 2 % Paraformaldehyd fixiert, gefolgt von 2 % Osmiumtetroxid für 2 Stunden. Anschließend wurden die Gewebe dehydriert und in Epoxidharz eingebettet. Ultradünne Schnitte (80 nm dick) wurden mit Bleicitrat behandelt und unter Verwendung eines Transmissionselektronenmikroskops (Hitachi, Japan) beobachtet. Von jeder Probe wurden nach dem Zufallsprinzip mindestens 10 Mikrofotografien angefertigt. Die Anzahl der Mitochondrien wurde auf mikroskopischen Aufnahmen blind gezählt46.

Mitochondrien wurden gemäß Kriterien, die durch frühere morphologische Studien47 validiert wurden, als verändert definiert: (1) deutlich verringerte Elektronendichte der Matrix (Verdünnung, Vakuolisierung, Kavitation); (2) fragmentierte und aufgeblähte Cristae (intrakristalline Schwellung); (3) teilweise oder vollständige Trennung der äußeren und inneren Membranen; (4) mitochondriale Schwellung. Dementsprechend wurden die folgenden Daten berechnet: (1) Dichte der Mitochondrien, (2) Prozentsatz veränderter Mitochondrien, (3) Mitochondrienschwellung, bewertet durch Messung des maximalen und minimalen Mitochondriendurchmessers.

Die Citrat-Synthase-Aktivität wurde mit dem MitoCheck Citrate Synthase Activity Assay Kit (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Die Citrat-Synthase-Aktivität wurde weiter auf den Proteingehalt normalisiert.

C2C12-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) (CRL-1772) erworben. Myoblasten wurden in DMEM mit niedrigem Glucosegehalt (Sigma-Aldrich Co. USA), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep), kultiviert. Myoblasten wurden durch Umstellung auf Differenzierungsmedium (DMEM, 2 % Pferdeserum, 1 % Pen/Strep) für 5 Tage in Myotubes differenziert. C2C12-Myotubes wurden 1 Stunde lang mit Myonectin-Protein (5 µg/ml) oder Vehikel vorbehandelt, gefolgt von einer 24-stündigen Stimulation mit DEX (100 µM) oder Vehikel. Für Genablationsexperimente wurden diese Zellen mit kleinen interferierenden RNAs (siRNAs) transfiziert, die auf PGC1α (L040773-01-0005), AMPKα1 (L-041035-00-0005), AMPKα2 (L-040809-00-0005) und nicht verwandte ( D-001810-10-05) siRNAs (Dharmacon Inc., Lafayette, CO) von Lipofectamine 2000 Regent (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) gemäß dem Protokoll des Herstellers. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen dem DEX-induzierten Atrophie-Experiment unterzogen. Der Myotube-Durchmesser wurde anhand des durchschnittlichen Durchmessers der Myotube in mindestens zehn Hochleistungsfeldern pro Vertiefung mithilfe der Image J-Software (National Institute of Health)45 bestimmt.

Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Die Unterschiede zwischen zwei Gruppen für Variablen mit Normalverteilungen wurden durch den ungepaarten Student-T-Test ausgewertet. Unterschiede zwischen drei oder mehr Gruppen wurden mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse mit einem Post-hoc-Tukey-Test oder Games-Howell-Test bewertet, der bei Vorliegen einer Varianzheterogenität als angemessen erachtet wurde. Ein AP-Wert < 0,05 bedeutete das Vorliegen eines statistisch signifikanten Unterschieds. Alle statistischen Berechnungen wurden mit der IBM SPSS Statistics 28-Software (SPSS Inc) durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Weitere Informationen zu den Daten erhalten Sie auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren. Die in dieser Studie generierten RNA-Sequenzierungsdaten wurden in der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank unter dem Zugangscode GSE233328 hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken Yoko Inoue für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Grant-in-Aid for Scientific Research A (2620H005710), Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (2620K21753) und Zuschüsse der Takeda Science Foundation (2600007594 und 2600007051) an N Ouchi (NO) unterstützt. KO wurde mit Grant-in-Aid for Scientific Research C (2621K08101) unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise von JST CREST (Fördernummer JPMJCR19H4)(TM) unterstützt.

Abteilung für Kardiologie, Graduiertenschule für Medizin der Universität Nagoya, Nagoya, Japan

Yuta Ozaki, Naoya Otaka, Hiroshi Kawanishi, Tomonobu Takikawa, Lixin Fang, Kunihiko Takahara, Sohta Ishihama, Mikito Takefuji, Katsuhiro Kato, Yuuki Shimizu, Yasuko K. Bando und Toyoaki Murohara

Abteilung für Molekulare Medizin und Kardiologie, Graduiertenschule für Medizin der Universität Nagoya, Nagoya, Japan

Koji Ohashi, Minako Tatsumi und Noriyuki Ouchi

Institut für Innovation für die Gesellschaft der Zukunft, Graduiertenschule für Medizin der Universität Nagoya, Nagoya, Japan

Aiko Inoue & Masafumi Kuzuya

Abteilung für kommunale Gesundheitsversorgung und Geriatrie, Graduiertenschule für Medizin der Universität Nagoya, Nagoya, Japan

Masafumi Kuzuya

Labor für Ernährungsbiochemie, Graduiertenschule für Ernährungs- und Umweltwissenschaften, Universität Shizuoka, Shizuoka, Japan

Shinji Miura

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YO entwarf die Forschungsstudie, führte die Experimente durch, erfasste die Daten, analysierte die Daten und schrieb das Manuskript. KO entwarf die Forschungsstudie, führte die Experimente durch, erfasste die Daten, analysierte die Daten, stellte Fachwissen im Zusammenhang mit den Experimenten zur Verfügung und verfasste das Manuskript. NO (N. Otaka), HK, TT, LF, KT, MT (M. Tatsumi), SI führten die Experimente durch, erfassten die Daten und analysierten die Daten. KK analysierte RNA-seq-Daten. MT (M. Takefuji), YS, YKB, AI, MK und TM entwarfen die Forschungsstudie und stellten Fachwissen im Zusammenhang mit den Experimenten zur Verfügung. SM stellte DN-AMPK-Tg-Mäuse zur Verfügung und stellte Fachwissen im Zusammenhang mit den Experimenten zur Verfügung. NO (N. Ouchi) entwarf die Forschungsstudie, analysierte die Daten, stellte Fachwissen im Zusammenhang mit den Experimenten zur Verfügung und verfasste das Manuskript. Alle Autoren beteiligten sich an der Interpretation der Ergebnisse und der Überarbeitung des Manuskripts.

Korrespondenz mit Koji Ohashi oder Noriyuki Ouchi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ozaki, Y., Ohashi, K., Otaka, N. et al. Myonectin schützt vor Funktionsstörungen der Skelettmuskulatur bei männlichen Mäusen durch Aktivierung des AMPK/PGC1α-Signalwegs. Nat Commun 14, 4675 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40435-2

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Eingegangen: 01. August 2022

Angenommen: 28. Juli 2023

Veröffentlicht: 04. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40435-2

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